一種甘薯近緣種抗旱基因ItTIFY10、編碼蛋白質及其克隆方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物抗旱性基因研究領域，具體設及一種甘馨近緣種抗旱基因 ItTIFYlO、編碼蛋白質及其克隆方法。
【背景技術】
[0002] 陸生植物在整個生長發育階段都可能受到逆境脅迫的影響，其中干旱是強烈制約 植物生長和作物產量的一個重要因素。植物為生存進化出一系列抵抗、耐受W及躲避逆境 脅迫的策略。有關植物抗逆性的研究一直是植物學領域的熱點。傳統的育種技術改良耐脅 迫性狀難度較大，而隨著分子生物學技術的發展及對植物抗逆分子機制的深入研究，分子 水平抗逆基因工程取得重大進展。采用轉基因技術向植物導入抗逆性外源基因已成為改良 植物抗逆性的新途徑。植物抗逆機制及相關基因工程的研究具有非常廣闊的前景和十分重 要的意義。
[0003]目前，越來越來多的抗旱相關基因已經被克隆和用來提高植物抗旱性。與抗旱相 關的轉錄因子有DREB、MYB/MYC、bZIP、WRKY、NAC和TIFY類等。其中，TIFY轉錄因子是植 物中特有的一類轉錄因子家族，其參與了植物葉片發育、誘導開花、激素信號轉導W及生物 和非生物脅迫等生理生化反應過程的調節機制。TIFY轉錄因子家族的一個最顯著特點是 家族各成員至少包含一個TIFY結構域，該保守結構域由36個氨基酸殘基構成。根據GATA 結構域的有無，TIFY轉錄因子家族可W被分為兩類：I類為含有GATA結構域的TIFY蛋白， 如AT4G24470、AT3G21175 和AT1G51600 等，II類為不含GATA結構域TIFY蛋白，如PEAP0D1 和PEAP0D2,目前已發現的TIFY蛋白大多屬于II類。2000年，Ni-shii等人在擬南芥中首次 發現基因AT4G24470,該基因在花器官中有表達并參與花開調控；后來發現擬南芥中TIFY1 參與葉柄和胚軸的伸長，TIFY4a(PPDl)和同源基因TIFY4b(PPD2)調控葉片生長，TIFY8參 與萊莉酸信號的傳遞度artelVanholmeetal.Thetifyfamilypreviouslyknownas ZIM[J].TrendsinPlantScience, 2007(12) :6);另外，從水稻中發現的基因OsTIFYl化可 W促進水稻種子發育，從而提高水稻產量，水稻中的大部分TIFY基因在葉片中表達，并且 萊莉酸、鹽脅迫、水分脅迫等都可W誘導TIFY的表達；水稻中基因TIFYlla的表達可W提 高水稻的抗鹽性和抗旱性（葉海燕.水稻基因低溫表達譜分析和TIFY家族逆境相關基因 的功能鑒定巧].湖北：華中農業大學，2011)。
[0004] 甘馨近緣種（Ipomoeatrifida化.B.K. )G.Don.)與栽培甘馨同屬B群，是甘馨祖 先種之一，由于其倍性低，染色體數目少，攜帶有優異的抗逆基因，廣泛用于模式研究和甘 馨遺傳改良。目前，還沒有甘馨近緣種TIFY家族成員功能的報道，對甘馨近緣種抗旱基因 的研究僅限于WRKY轉錄因子，因此，甘馨近緣種抗旱基因TIFY的克隆W及對其表達的研究 具有十分重要的意義，從而為農作物進行遺傳改良提供一條新的途徑。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種從甘馨近緣種中獲得的抗旱基因ItTIFYlO的核巧酸 序列。
[0006] 本發明的另一目的在于提供所述甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO編碼的氨基酸序 列。
[0007] 同時，本發明還提供所述甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO的克隆方法。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供了一種甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO,其核巧酸序 列如沈QIDNO:1所示。
[0009] 上述甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQIDNO:2 所示。
[0010] 一種甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO的克隆方法，包括W下步驟：
[0011] (1)選用已經長出膨大根的甘馨近緣種作為實驗材料，經低溫誘導后，將實驗材料 的纖維根、膨大根、莖和葉組織置于研鉢中研磨成粉末，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并 采用DNAaseI消化總RNA中的DNA殘留，RNA含量及質量采用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0012] (2)向上述RNA溶液中混合到反轉錄體系中，所述反轉錄體系為：5XMLVbuffer 5μL、dNTP4μLRNaseinhibitor0. 5μUM-MLV1μL和DEPC水 4μL;并將該混合液置 于PCR儀中，設置溫度為42°C，時間為90min，即得cDNA序列；
[0013] (3)根據轉錄組測序結果設計甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO編碼區引物：
[0014]正向引物：5 ' -ATGAGTTCGTCGGAAG-3，
[0015]反向引物：5' -TCAGTGCTCAATTTTGAC-3，
[0016] 反應體系：cDNA2μLlOXbuffer2. 5μLdNTP2. 5μLprimers2μLTaq酶 0. 3μL超純水15. 7μL共25μL反應體系；
[0017] ?〇?反應程序：94°(：預變性5111111，94°(：變性303,60°(：復性1111111，72°(：延伸303,30 個循環后，72°C延伸7min，反應完后采用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR產物；
[0018] (4)PCR反應產物回收純化后與p-Easy-T載體連接，連接產物轉化化ansl-T感 受態細胞，采用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得 ItTIFYlO基因。
[0019] 本發明采用RT-PCR技術對甘馨近緣種ItTIFYlO基因進行了研究，首次從甘馨近 緣種的纖維根、膨大根、莖和葉組織中得到ItTIFYlO基因序列，并對其所編碼的氨基酸序 列進行了分析，為進一步研究甘馨近緣種ItTIFYlO基因的表達、調控奠定了基礎；在干旱 脅迫條件下，通過轉基因實驗分析表明該基因的超量表達提高了甘馨近緣種的抗旱性；另 夕1>，該基因具有適合于甘馨近緣種等雙子葉植物表達的優化密碼子，其基因工程的受體植 物除了單子葉植物，如水稻、玉米、小麥等之外更加適合于大豆、棉花、煙草等雙子葉植物。
【具體實施方式】
[0020] W下結合實施例對本發明作進一步詳細說明。
[0021] 本發明所提供的抗旱基因從甘馨近緣種（Ipomoeatrifida化.B.K. )G.Don.)中克 隆，命名為ItTIFYlO基因，核巧酸序列如SEQIDNO:1所示，基因長68化p。
[0022] 上述甘馨近緣種抗旱基因編碼的蛋白質命名為ItTIFYlO蛋白質，其氨基酸序列 如SEQIDNO:2所示，含228個氨基酸。
[0023] 上述甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO的克隆方法，包括W下步驟：
[0024] (1)選用已經長出膨大根的甘馨近緣種作為實驗材料，經低溫誘導后，將實驗材料 的纖維根、膨大根、莖和葉組織置于研鉢中研磨成粉末，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并 采用DNAaseI消化總RNA中的DNA殘留，RNA含量及質量采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；
[0025] 似向上述RNA溶液中混合到反轉錄體系中，所述反轉錄體系為：5XMLVbuffer 5μLdNTP4μLRNaseinhibitor0. 5μLM-MLV1μL和DEPC水 4μL;并將該混合液 置于PCR儀中，設置溫度為42°C，時間為90min，即得cDNA序列；
[0026] (3)根據轉錄組測序結果設計甘馨近緣種抗旱基因ItTIFYlO編碼區引物：
[0027]正向引物：5 ' -ATGAGTTCGTCGGAAG-3 '
[0028]反向引物：5 ' -TCAGTGCTCAATTTTGAC-3 '
[0029]反應體系：cDNA2μLlOXbuffer2. 5μLdNTP2. 5μLprimers2μLTaq酶 0. 3μL超純水15. 7μL共25μL反應體系；
[0030] ?〇?反應程序：94°(：預變性5111111，94°(：變性303,60°(：復性1111111，72°(：延伸303,30 個循環后，72°C延伸7min，反應完后采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR產物；
[003。巧)PCR反應產物回收純化后與p-Easy-T載體連接，連接產物轉化Transl-T感 受態細胞，采用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得 ItTIFYlO基因。
[0032]ItTIFYlO的轉基因功能驗證：利用農桿菌浸染方法獲得ItTIFYlO基因超量表達 的轉基因煙草植株，將該轉基因煙草植株與正常煙草植株同時在干旱脅迫條件下進行抗旱 性對比試驗，發現ItTIFYlO基因超量表達的轉基因煙草植株確實在一定程度上比正常煙 草植株具有較高的抗旱性。
【主權項】
1. 一種甘薯近緣種抗旱基因ItTIFYlO,其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO:1所 不。2. -種如權利要求1所述甘薯近緣種抗旱基因ItTIFYlO編碼的蛋白質，其特征在于， 其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。3. -種如權利要求1所述甘薯近緣種抗旱基因ItTIFYlO的克隆方法，包括以下步驟： (1) 選用已經長出膨大根的甘薯近緣種作為實驗材料，經低溫誘導后，將實驗材料的纖 維根、膨大根、莖和葉組織置于研缽中研磨成粉末，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并采用 DNAaseI消化總RNA中的DNA殘留，RNA含量及質量采用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測； (2) 向上述RNA溶液中混合到反轉錄體系中，所述反轉錄體系為：5XMLVbuffer 5μL、dNTP4μL、RNaseinhibitor0· 5μL、M-MLV1μL和DEPC水 4μL;并將該混合液置 于PCR儀中，設置溫度為42°C，時間為90min，即得cDNA序列； (3) 根據轉錄組測序結果設計甘薯近緣種抗旱基因ItTIFYlO編碼區引物： 正向引物：5 ' -ATGAGTTCGTCGGAAG-3 ' 反向引物：5 ' -TCAGTGCTCAATTTTGAC-3 ' 反應體系：cDNA2yL，10Xbuffer2.5yL，dNTP2.5yL，primers2yL，Taq酶 0· 3μL，超純水15. 7μL，共25μL反應體系； 卩〇?反應程序：94°(：預變性51^11，94°(：變性3〇8,60°(：復性11^11，72°(：延伸3〇8,30個循 環后，72°C延伸7min，反應完后采用1 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR產物； (4) PCR反應產物回收純化后與p-Easy-T載體連接，連接產物轉化Trans1-T感受態細 胞，采用藍白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經PCR進一步驗證后測序，獲得ItTIFYlO 基因。
【專利摘要】本發明公開了一種甘薯近緣種抗旱基因ItTIFY10、編碼蛋白質及其克隆方法。所述抗旱基因ItTIFY10的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；所述抗旱基因ItTIFY10編碼的蛋白質的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。本發明采用RT-PCR技術對甘薯近緣種ItTIFY10基因進行了研究，首次從甘薯近緣種的纖維根、膨大根、莖和葉組織中得到ItTIFY10基因序列，并對其所編碼的氨基酸序列進行了分析，為進一步研究甘薯近緣種ItTIFY10基因的表達、調控奠定了基礎；在干旱脅迫條件下，通過轉基因實驗分析表明該基因的超量表達提高了甘薯近緣種的抗旱性。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/29, C07K14/415
【公開號】CN105368843
【申請號】CN201510676219
【發明人】曹清河, 張安, 唐君, 周志林, 趙冬蘭, 謝政文, 陳錦洋, 王姣
【申請人】江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年10月19日