一種制備胰凝乳蛋白酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，具體地說是靈活運用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現代蛋白純化技術，從合格的動物胰臟中制備胰凝乳蛋白酶的方法。
【背景技術】
[0002]胰凝乳蛋白酶chymotrypsin，是一種典型的絲氨酸蛋白酶，脊椎動物的消化酶。EC 3.421.1。在胰臟中以酶前體物質胰凝乳蛋白酶原的形態生物合成，隨胰液分泌出去。在小腸受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，轉變成活性的胰凝乳蛋白酶。
[0003]胰凝乳蛋白酶經濟價值極高，在醫藥方面主要作為治療藥物:(1).用于創傷或手術后傷口愈合(2)抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血腫(3)乳房手術后浮腫、中耳炎、鼻炎等(4)本品對眼球睫狀韌帶有選擇性松解作用，故可用于白內障摘除，使晶狀體比較容易地移去。
[0004]藥用的胰凝乳蛋白酶主要從牛胰臟中提取，而本發明是靈活運用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現代蛋白純化技術，使用磷酸鹽、丙酮、硫酸銨等價格便宜的輔料，制備胰凝乳蛋白酶，不僅在一定程度上降低了成本，且產品的收率也能達到20萬單位/kg胰臟。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是從合格的動物胰臟中提取胰凝乳蛋白酶。
[0006]本發明的技術方案是:將合格的動物胰臟經過絞碎后，靈活運用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液提純及硫酸銨鹽析結晶等現代蛋白純化技術，制備胰凝乳蛋白酶的方法。本發明操作簡單、成本低，非常適合于規模化大生產。包括如下步驟:
(1)水解:將新鮮或冷凍豬胰臟絞碎置于容器中，加入2~5倍量0°C以下的丙酮，在0°C左右攪拌脫水0.5-1.5小時，離心得沉淀物，加入0.5-1.5倍量的水及0.01-0.02倍量胰酶攪拌溶解，用6%~10%氫氧化鈉溶液調至pH值至6.0-9.0，于15°C ~25°C保溫攪拌1~3小時，再加入娃藻土充分攪拌，過濾；
(2)沉淀:收集濾液與1.5~3倍量丙酮攪勻，靜置10~14小時，虹吸棄去上層丙酮清液，用1.5-2倍量丙酮分3?4次洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥，即得胰凝乳蛋白酶粗品；
(3)提純:將粗品與45~60倍量磷酸緩沖液攪拌0.5-1.5小時，于15°C ~25°C靜置15-25小時，按照溶液的體積加入其量約3%~7%的硅藻土拌勻，過濾。往濾液中加入硫酸銨，至硫酸銨濃度達35%~45%。過濾，得鹽析物；將鹽析物再按lg:8~10ml的比例溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，直至微渾，0°C ~8°C下靜置48~72小時，慢慢形成針狀結晶，過濾；
(4)干燥:濾取晶體并用水沖洗3~5次，冷凍干燥，即可得胰凝乳蛋白酶。
【具體實施方式】
[0007]下面結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0008]實施例1
所述的利用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液提純及硫酸銨結晶等現代蛋白純化技術，制備胰凝乳蛋白酶的方法，包括如下步驟:
1.水解:將新鮮豬胰臟絞碎置于容器中，加入3倍量0°C的丙酮，在0°C左右攪拌脫水1小時，離心得沉淀物，加入1倍量水及0.015倍量胰酶攪拌溶解，用8%氫氧化鈉溶液調至pH值至7.5，于20°C保溫攪拌2小時，再加入0.01倍量硅藻土充分攪拌，過濾。
[0009]2.沉淀:收集濾液與2倍量丙酮攪勻，靜置12小時，虹吸棄去上層丙酮清液，用2倍量丙酮分4次洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥，約得120g胰凝乳蛋白酶粗品。
[0010]3.提純:將粗品與52倍量磷酸緩沖液攪拌混合1小時，于20 V靜置20小時，加入其量約5%的娃藻土拌勾，過濾。往濾液中加入硫酸錢至濃度達40%，過濾，約得35g鹽析物；將鹽析物再按lg: 10ml的比例溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，直至微渾，4°C下靜置72小時，慢慢形成針狀結晶，過濾。
[0011]4.干燥:濾取晶體并用水沖洗3次，冷凍干燥，約可得4.5g胰凝乳蛋白酶。
[0012]以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。
【主權項】
1.一種制備胰凝乳蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟: (1)水解:將新鮮或冷凍動物胰臟絞碎置于容器中，加入丙酮攪拌脫水，離心得沉淀物，加入水及胰酶攪拌溶解，用氫氧化鈉溶液調至pH值，保溫攪拌，再加入硅藻土充分攪拌，過濾； (2)沉淀:收集濾液，加入丙酮攪勻，靜置，虹吸棄去上層丙酮清液，然后用丙酮洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥；得胰凝乳蛋白酶粗品； (3)提純:將粗品用磷酸緩沖液溶解，攪拌混合，靜置，然后加入硅藻土拌勻，過濾；往濾液中加入硫酸銨，過濾后可得鹽析物；將鹽析物再溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，靜置，過濾； (4)濾取晶體并用水沖洗，冷凍干燥，即可得胰凝乳蛋白酶。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，丙酮與胰臟的比例為2~5L:lkg，丙酮溫度0°C以下；氫氧化鈉溶液濃度為6%~10% ;溶液的pH值調節到6.0-9.0 ;于15°C ~25°C保溫攪拌約1~3小時；過濾前，加入硅藻土進行充分攪拌。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，丙酮與濾液的體積比為1.5-3:1 ；靜置時間為:10~14小時；棄去上清液后，用丙酮洗滌沉淀物。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，粗品與磷酸緩沖液的比例是:lg:45~60ml ;溶液于15°C ~25°C靜置15~25小時；按照溶液的體積加入其量3%~7%重量的硅藻土 ；往濾液中加入硫酸銨的量為使溶液的濃度達到35%~45% ;鹽析物與碳酸緩沖液的比例是:lg:8~10ml ;加入飽和硫酸銨溶液的量為至溶液微渾；靜置溫度是:0°C ~8°C，時間為:48~72小時。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:得到的胰凝乳蛋白酶晶體要進行冷凍干燥。
【專利摘要】本發明公開了一種制備胰凝乳蛋白酶的方法。本發明的技術方案是將動物胰臟經過絞碎，靈活運用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現代蛋白純化技術，制備胰凝乳蛋白酶。本發明操作簡單、成本低，非常適用于規模化大生產。
【IPC分類】C12N9/76
【公開號】CN105368810
【申請號】CN201510826531
【發明人】劉乃山, 趙葉華, 劉翠珍
【申請人】青島康原藥業有限公司
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年11月25日