一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于農業和環境污染治理技術領域，具體涉及一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法。
【背景技術】
[0002]在重金屬污染嚴重的土壤生態系統中，微生物處在重金屬脅迫環境下，經過長期的自然選擇，也會形成一些獨特的微生物群落，其中包括一些重金屬耐性微生物，成為具有較高應用價值的土壤修復材料。微生物對污染土壤的修復作用表現為促進土壤的生物改造或生物改良、對土壤重金屬起到生物轉化和生物吸附作用，或者通過吸收、沉淀、固定、共價轉化等方式，將土壤中的有毒金屬離子低毒脂，從而降低重金屬對土壤環境的毒害，并且具有高效率、低成本、無二次污染等優勢。利用微生物降低土壤重金屬毒性已經成為修復重金屬污染環境的有效措施，受到環境治理工作者的普遍關注。
[0003]獲得重金屬耐性微生物菌株是成功利用微生物修復重金屬污染土壤的關鍵所在。野外采樣、室內重金屬脅迫分離培養是篩選重金屬耐性微生物的常用方法，具有取樣簡單、操作方便和成本較低等優點，但同時存在實驗結果預見性較低，篩選效率不高等不足。
【發明內容】
[0004]本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法
[0005]為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案為:
[0006]—種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法，具體包括以下步驟:
[0007](1)選擇誘捕地:選擇重金屬污染嚴重的采礦廢棄地為重金屬耐性真菌誘捕地，采集樣品，分析誘捕地土壤重金屬污染情況，確定誘捕地土壤特征污染元素；
[0008](2)制備誘捕培養基:以Martin培養基為基本培養基，向基本培養基中加入誘捕地土壤特征污染元素中的一種或幾種重金屬元素，制備得到誘捕不同重金屬耐性真菌的誘捕培養基，所述誘捕培養基為固體培養基；
[0009](3)將誘捕培養基裝入誘捕袋中，所述誘捕袋為尼龍網袋，再將誘捕袋埋入誘捕地土壤中，2?3個月后，取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養基研磨后過篩，加無菌水稀釋后震蕩培養，隨后配制成不同濃度梯度的誘捕培養基稀釋液；
[0010](4)取各濃度的誘捕培養基稀釋液，分別涂布于誘捕培養基平板上，培養后挑取單菌落，重復劃線培養，直至獲得純培養物；所述純培養物即為重金屬耐性真菌。
[0011]上述方案中，步驟(2)所述重金屬元素在Martin培養基中的濃度與其在誘捕地土壤中的濃度相當。
[0012]上述方案中，步驟(3)所述誘捕袋的網眼為350目?450目。
[0013]上述方案中，步驟(3)所述將誘捕袋埋入誘捕地土壤中的具體操作步驟為:每年春季氣溫穩定通過25°C之后，在誘捕地上隨機設置5?10個樣方，每個樣方內按梅花5點法，從表土往下挖深20?25cm的豎坑5個，每個豎坑底部水平擺放1個裝有誘捕培養基的誘捕袋，回填表土與地表平。
[0014]上述方案中，步驟(3)所述振蕩培養的條件為:28°C?30°C、100r/min?110r/min條件下振蕩培養30min?60min。
[0015]上述方案中，步驟(3)中，誘捕培養基研磨后過30目篩。
[0016]上述方案中，步驟(4)所述培養的條件為:28°C?30°C培養4?5天。
[0017]本發明所述從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法，其關鍵的點在于:選擇重金屬污染嚴重的采礦廢棄地為誘捕地，以添加了誘捕地土壤特征污染元素的Martin培養基為誘捕培養基，春季氣溫穩定通過25 °C時將裝有誘捕培養基的誘捕袋埋入土中，2?3個月后取出誘捕袋，利用袋中的誘捕培養基制備稀釋液，采用涂布法利用誘捕培養基分離、篩選對誘捕地土壤特征污染元素具有耐性的真菌。進一步地，挑取獲得的純培養物(重金屬耐性真菌)的真菌菌絲和孢子，置于光鏡下(10X40倍)直接觀察菌絲和孢子的形態特征，鑒定所誘捕的真菌所屬的種屬。
[0018]本發明的有益效果如下:(1)本發明所述方法篩選預見性好:本發明以重金屬污染嚴重的礦業廢棄地為誘捕地，采用含有土壤特征污染元素的真菌培養基Martin為誘捕培養基誘捕重金屬耐性真菌，目標明確，針對性強，大大提高了誘捕、篩選重金屬耐性真菌的預見性。(2)篩選效率高:本發明中，將裝有誘捕培養基的誘捕袋埋入誘捕地土壤中，由于誘捕培養基在土壤中與重金屬耐性真菌直接接觸，重金屬耐性真菌借助誘捕培養基的營養生活、繁殖，使得誘捕培養基中重金屬耐性真菌數量增加，有效提高了誘捕、篩選重金屬耐性真菌的效率，可以快速獲得重金屬耐性真菌。采用本發明所述從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法篩選土壤重金屬耐性真菌，獲得土壤特征污染元素耐性真菌的誘捕率達到100%。
【具體實施方式】
[0019]為了更好地理解本發明，下面結合實施例進一步闡明本發明的內容，但本發明的內容不僅僅局限于下面的實施例。
[0020]以下實施例中，選擇湖北大冶銅綠山銅鐵礦廢棄露采場為重金屬耐性真菌誘捕地。土壤平均Cu含量為518.32mg/Kg、平均Cd含量為2.05mg/Kg,均達到重度污染水平。Cu、Cd為誘捕土壤的特征污染元素。
[0021]實施例1誘捕重金屬Cu耐性真菌
[0022]2011年5月10日，將裝入誘捕培養基(Cu含量為550mg/Kg的Martin固體培養基)的誘捕袋(誘捕袋的大小為15cmX 10cm，網眼為400目)埋入誘捕地。誘捕地設5個樣方，樣方大小為3mX 3m，每個樣方內按梅花5點法，從表土往下挖開口 30cmX30cm、深20?25cm的豎坑5個，每個豎坑底部水平擺放1個裝有誘捕培養基的誘捕袋，回填表土與地表平，共計埋入25個誘捕袋。
[0023]2011年7月10日，從土壤中取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養基研磨后過30目篩，取10g培養基用90ml無菌水稀釋，30°C、110r/min、振蕩培養30min后，靜置lOmin，分別配制成濃度梯度為10 2、ιο 3、10 4和10 5的稀釋液；用涂布法分別接種于誘捕培養基平板上，28°C培養5d后，挑取單菌落，經過重復劃線培養，從25個誘捕袋中獲得34個真菌純培養菌株，每個誘捕袋都分離得到重金屬Cu耐性真菌，誘捕袋平均分離到重金屬Cu耐性真菌的菌株1.36個，誘捕率為100%。經鑒定和復篩，34個重金屬Cu耐性真菌菌株中，21株為雜色曲霉(Aspergillus versicolor)，13 株為黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0024]實施例2誘捕重金屬Cd耐性真菌
[0025]2012年6月5日，將裝入誘捕培養基(Cd含量為2mg/Kg的Martin固體培養基)的誘捕袋(誘捕袋的大小為15cmX 10cm，網眼為400目)埋入誘捕地。誘捕地設5個樣方，樣方大小為3mX 3m，每個樣方內按梅花5點法，從表土往下挖開口 30cmX30cm、深20?25cm的豎坑5個，每個豎坑底部水平擺放1個裝有誘捕培養基的誘捕袋，回填表土與地表平，共計埋入25個誘捕袋。
[0026]2012年8月5日，從土壤中取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養基研磨后，參照實施例1的方法、步驟、條件，制備誘捕培養基稀釋液、分離培養重金屬Cd耐性真菌。從25個誘捕袋中獲得29個真菌純培養菌株，每個誘捕袋都分離得到重金屬Cd耐性真菌，誘捕袋平均分離到重金屬Cd耐性真菌的菌株1.16個，誘捕率為100%。經鑒定和復篩，29個重金屬Cd耐性真菌菌株中，17株為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，12株為黑曲霉(Aspergillusniger)。
[0027]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選擇誘捕地:選擇重金屬污染嚴重的采礦廢棄地為重金屬耐性真菌誘捕地，采集樣品，分析誘捕地土壤重金屬污染情況，確定誘捕地土壤特征污染元素； (2)制備誘捕培養基:以Martin培養基為基本培養基，向基本培養基中加入誘捕地土壤特征污染元素中的一種或幾種重金屬元素，制備得到誘捕不同重金屬耐性真菌的誘捕培養基，所述誘捕培養基為固體培養基； (3)將誘捕培養基裝入誘捕袋中，所述誘捕袋為尼龍網袋，再將誘捕袋埋入誘捕地土壤中，2~3個月后，取出誘捕袋，將袋中的誘捕培養基研磨后過篩，加無菌水稀釋后震蕩培養，隨后配制成不同濃度梯度的誘捕培養基稀釋液； (4)取各濃度的誘捕培養基稀釋液，分別涂布于誘捕培養基平板上，培養后挑取單菌落，重復劃線培養，直至獲得純培養物；所述純培養物即為重金屬耐性真菌。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述重金屬元素在Martin培養基中的濃度與其在誘捕地土壤中的濃度相當。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述將誘捕袋埋入誘捕地土壤中的具體操作步驟為:每年春季氣溫穩定通過25°C之后，在誘捕地上隨機設置5~10個樣方，每個樣方內按梅花5點法，從表土往下挖深20~25cm的豎坑5個，每個豎坑底部水平擺放1個裝有誘捕培養基的誘捕袋，回填表土與地表平。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，誘捕培養基研磨后過30目篩。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述振蕩培養的條件為:28°C ~30°C、100r/min~110 r/min 條件下振蕩培養 30min~60min。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述培養的條件為:28°C-30°C培養4~5天。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述誘捕袋的網眼為350目-450目。
【專利摘要】本發明屬于農業和環境污染治理技術領域，具體涉及一種從土壤中誘捕重金屬耐性真菌的方法。所述方法為：選擇重金屬污染嚴重的采礦廢棄地為誘捕地，以添加誘捕地土壤特征污染元素的Martin培養基為誘捕培養基，春季氣溫穩定通過25℃時將裝有誘捕培養基的誘捕袋埋入土中，2～3個月后取出誘捕袋，利用袋中的誘捕培養基制備稀釋液，采用涂布法利用誘捕培養基分離、篩選對誘捕地土壤特征污染元素具有耐性的真菌。本發明方法的目標明確，針對性強，誘捕、篩選重金屬耐性真菌的預見性好；同時還具有誘捕、篩選重金屬耐性真菌的效率高的優點，采用本發明所述方法篩選土壤重金屬耐性真菌，獲得土壤特征污染元素耐性真菌的誘捕率達到100%。
【IPC分類】C12N1/14
【公開號】CN105368724
【申請號】CN201510966488
【發明人】康薇, 鄭進
【申請人】湖北理工學院
【公開日】2016年3月2日
【申請日】2015年12月18日