一種急性心肌梗死標志物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種急性心肌梗死標志物及其應用，更具體 的涉及RFX2及其激動劑在制備急性心肌梗死診療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 急性心肌梗死（AMI)在最近幾年的發病率逐漸出現上升的態勢，并且趨于年輕 化，是當今導致人類死亡的主要病因之一。本病常見于歐美國家的肥胖者，中國在近些年來 此病的發生率也呈現明顯上升的趨勢。本病發作時主要臨床表現為有激烈持久的胸骨后疼 痛，經休息或者含服硝酸甘油藥物后不能減緩，同時伴隨血清心肌壞死標記物的增高以及 動態心電圖的演變。急性心肌梗死的產生與冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂引發血管堵塞密切 相關，血管梗阻致使心肌發生缺血而壞死，此時構成急性心肌梗死。目前該病的治療正在不 斷進步，包括藥物治療及創傷性治療手段使病人的預后大為改善。但是，仍有很多病人藥物 治療效果欠佳，同時又喪失了手術介入治療的時機。針對這樣的一些病人，除了常規的藥物 等姑息性對癥治療外，需要探求一些新的治療方法。
[0003] 本研究通過AMI的外周血RNA表達譜差異分析，來研究具體有哪些基因參與了AMI 過程，為將來AMI早期基因診斷奠定基礎。發明人對6例急性心肌梗死病例組和6對照組 血液樣本進行高通量測序，結合生物信息學方法進行基因篩選，在差異表達明顯的基因中 挑選出低表達的候選基因RFX2,現有研究中并沒有RFX2和急性心肌梗死相關的報道，進一 步，發明人進行了分子驗證，證實了RFX2在急性心肌梗死組中高表達。本發明提供了一種 新的急性心肌梗死的監測治療靶點，具有重要的臨床應用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種急性心肌梗死診斷制劑，所述急性心肌梗死診斷制劑 檢測RFX2基因和/或基因的表達產物。進一步的，所述的RFX2基因和/或基因的表達產 物在急性心肌梗死組織或外周血中低表達。
[0005] 進一步，所述急性心肌梗死診斷制劑采用熒光定量PCR試劑盒、基因芯片、免疫方 法檢測急性心肌梗死組織或外周血中RFX2基因的表達。優選的，所述的熒光定量PCR試劑 盒中含有一對特異性擴增RFX2基因的引物；所述的基因芯片中包括與RFX2基因的核酸序 列雜交的探針。更優選的，熒光定量PCR試劑盒內含有特異性檢測RFX2基因的上游引物和 下游引物，上游引物序列為SEQIDN0. 1，下游引物序列為SEQIDN0. 2。
[0006] 進一步，所述的急性心肌梗死的診斷制劑采用免疫方法檢測急性心肌梗死組織或 外周血中RFX2基因的表達產物。優選的，所述免疫方法為ELISA檢測和/或膠體金檢測。 進一步，所述檢測RFX2蛋白的ELISA法為使用ELISA檢測試劑盒。所述試劑盒中的抗體可 采用市售的RFX2單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，所述的試劑盒包括：包被RFX2抗體 的固相載體，酶標抗體，酶的底物，蛋白標準品，陰性對照品，稀釋液，洗滌液，酶反應終止液 等。
[0007] 進一步，所述檢測RFX2蛋白的膠體金法為使用檢測試劑盒，所述的抗體可采用市 售的RFX2單克隆抗體或多克隆抗體。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒采用膠體金免疫層 析技術或膠體金滲濾法。進一步，所述的膠體金檢測試劑盒硝酸纖維素膜上的檢測區（T) 噴點有抗RFX2抗體、質控區（C)噴點有免疫球蛋白IgG。
[0008] 本發明的目的在于提供上述急性心肌梗死診斷制劑在制備急性心肌梗死診斷工 具中的應用。
[0009] 本發明的目的在于提供一種治療急性心肌梗死的制劑，所述制劑中含有促進RFX2 基因的轉錄或表達的試劑或化合物。進一步的，所述的RFX2基因和/或基因的表達產物在 急性心肌梗死組織或外周血中低表達。
[0010] 本領域人員熟知促進基因及其表達產物的表達通常可以采用下述方法中的一種 和/或幾種：激活分子標志物的啟動子、激活分子標志物表達的蛋白或因子、導入促進分子 標志物轉錄或表達的載體。
[0011] 優選的，所述治療急性心肌梗死的制劑中含有促進RFX2基因的轉錄或表達的載 體和/或激活RFX2基因的啟動子和/或激活RFX2基因表達的蛋白或因子。
[0012] 本發明的目的在于提供上述治療急性心肌梗死的制劑在制備急性心肌梗死治療 藥物或試劑中的應用。
[0013] 為實現上述目的，本發明首先通過高通量測序結合生物信息學方法篩選到候選基 因RFX2基因，進而通過分子生物學方法驗證了RFX2基因與急性心肌梗死的關系：RFX2基 因與急性心肌梗死具有很好的相關性，可用于制備急性心肌梗死輔助診斷制劑，具有重要 的臨床應用價值。
[0014] 熒光定量PCR法是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標 記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板 的初始濃度。熒光定量PCR的出現，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實現了絕對定 量。多種檢測系統的出現，使實驗的選擇性更強。自動化操作提高了工作效率，反應快速、 重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰。
[0015] 基因芯片又稱為DNA微陣列（DNAmicroarray)，可分為三種主要類型：1)固定在 聚合物基片（尼龍膜，硝酸纖維膜等）表面上的核酸探針或cDNA片段，通常用同位素標記 的靶基因與其雜交，通過放射顯影技術進行檢測。2)用點樣法固定在玻璃板上的DNA探針 陣列，通過與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。3)在玻璃等硬質表面上直接合成的寡核苷 酸探針陣列，與熒光標記的靶基因雜交進行檢測。基因芯片作為一種先進的、大規模、高通 量檢測技術，應用于疾病的診斷，其優點有以下幾個方面：一是高度的靈敏性和準確性；二 是快速簡便；二是可同時檢測多種疾病。
[0016] 酶聯免疫吸附實驗（ELISA)即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標 記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體 等，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。ELISA檢測試劑盒根據檢測目的和操作 步驟可分為間接法、雙抗夾心法、競爭法、雙位點一步法、捕獲法測IgM抗體、應用親和素和 生物素的ELISA。ELISA檢測試劑盒中生色底物可選擇辣根過氧化物酶（HRP)或者堿性磷 酸酶（AP)。
[0017] 常用的免疫膠體金檢測技術：（1)免疫膠體金光鏡染色法細胞懸液涂片或組織切 片，可用膠體金標記的抗體進行染色，也可在膠體金標記的基礎上，以銀顯影液增強標記， 使被還原的銀原子沉積于已標記的金顆粒表面，可明顯增強膠體金標記的敏感性。（2)免疫 膠體金電鏡染色法可用膠體金標記的抗體或抗抗體與負染病毒樣本或組織超薄切片結合， 然后進行負染。可用于病毒形態的觀察和病毒檢測。（3)斑點免疫金滲濾法應用微孔濾膜 作載體，先將抗原或抗體點于膜上，封閉后加待檢樣本，洗滌后用膠體金標記的抗體檢測 相應的抗原或抗體。（4)膠體金免疫層析法將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠 體金標記試劑（抗體或單克隆抗體）吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本 墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，當移動至固 定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留， 聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十分方 便。
[0018] 本發明的藥劑學上可接受的載體為在制劑時通常利用的載體，該載體包含乳糖 (lactose)、右旋糖（dextrose)、鹿糖（sucrose)、山梨醇（sorbitol)、甘露醇（mannitol)、 淀粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽（alginate)、凝膠（gelatin)、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙 稀P比略燒酮（polyvinylpyrrolidone)、纖維素（cellulose)、水、糖衆、甲基纖維素（methyl cellulose)、羥基苯甲酸甲酯（methylhydroxybenzoate)、丙基羥基苯甲酸丙酯（propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸儀（stearicacidmagnesium)及礦物油（mineraloil) 等，但并非局限于此。
[0019] 本發明的藥劑學可接受的載體除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜 味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑等。藥劑學上許可的適合的載體和制劑詳細記載于雷 明登氏藥學全書。
[0020] 本發明的藥劑學組合物能通過口服或非口服進行給藥，作為非口服給藥時，能通 過靜脈內注射，鼻腔內注射，局部注射，腦室內注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，經皮 給藥等方式進行給藥。
[0021] 本發明的藥劑學組合物的適合的給藥劑量根據制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應靈敏性之類的因素而可以 進行多種處方，通常，熟練的醫生能夠容易地決定及處方對所希望的治療或預防有效的給 藥劑量。
[0022] 本發明的藥劑學組合物根據本發明所屬技術領域的普通技術人員可以容易實施 的方法，利用藥劑學上能接受的載體和/或賦形劑來進行制劑化，從而能夠以單位用量形 態制備或者內裝在多容量容器內來制備。此時，劑型是油性或者水性介質中的溶液、懸浮液 或乳化液形態，或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊劑形態，還可以包括分 散劑或者穩定劑。
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