一種潮間帶微小桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種潮間帶微小桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] T-2毒素是由多種鐮刀菌（Fusarium)產生的一種倍半萜類真菌毒素，是單端孢霉 烯族毒素類中毒性最強的毒素，其毒性官能團為環氧環、（；-(；。間雙鍵、羥基、乙酰氧基，毒 性主要表現為細胞毒性和免疫系統毒性，具有致畸、致癌、致突變的"三致"作用，對人畜健 康具有潛在的致癌威脅。T-2毒素普遍存在于水產飼料中，而對蝦對真菌毒素具有很強的耐 受性，T-2毒素極易在對蝦中蓄積。此外，T-2毒素純品為白色針狀晶體，難溶于水，易溶于 甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、丙酮等極性有機溶劑，性質穩定，有很強的耐熱性和紫外線耐受 性。有研究報道T-2毒素常溫放置6~7年或高溫至200°C毒力仍無減弱，不容易清除。因 此，養殖對蝦中T-2毒素的殘留已經嚴重影響對蝦產業鏈的健康發展。如何有效消解對蝦 中殘留T-2毒素的危害成為亟待解決的問題。目前常見的真菌毒素消除技術有物理法、化 學法和生物法。因物理和化學方法降毒不僅收效甚微，且增加不安全性，所以生物降解真菌 毒素具有誘人的前景。國內有程波財對抑制鐮刀菌及降解兩種真菌毒素的益生菌篩選和機 理進行了研究，施琦等人從對蝦養殖環境中分離到的5株鐮孢菌作為試驗菌種，在其產毒 培養過程中分離出彎曲假單胞菌和尼泊爾葡萄球菌，對T-2毒素的降解率分別為90. 9%和 85. 5%。國外有研究者報道灌木酒神菊屬（Baccharisspp.)能將T-2毒素氧化成3' -0H T-2或3'-OHHT-2,降低了其毒性。ChristopherYoung發現雞腸道混合微生物可清除包 括T-2毒素在內的各種單端孢霉烯族化合物。傳統發酵蝦醬中存在大量有益的發酵微生 物，連鑫對傳統蝦醬中呈味優勢菌進行分離鑒定，分離出一株產香季氏畢赤氏酵母（Pichia gilliermondii)，一株產蛋白酶黑曲霉（Aspergillusniger);孫業盈等人從猛子4下醬中分 離鑒定出一株中度嗜鹽菌MKY20,經初步鑒定為枝芽孢桿菌屬（Virgibacillus)中的鹽脫 氮枝芽孢桿菌（Virgibacillushalodenitrificans);杜云建等人用米曲霉發酵生產4下醬； 袁三平利用乳酸菌發酵蝦醬，不僅提高了蝦醬的口味，而且降低了蝦醬中亞硝酸鹽的含量； 劉樹青利用酵母菌并結合酶解發酵蝦醬，不僅增加了蝦醬產品的濃香度，更提高了產品的 營養成分；孟凌玉采用混合微生物發酵法改良蝦頭酶解產物風味和發酵工藝。但目前利用 蝦醬中微生物降解T-2毒素沒有報道。
【發明內容】
[0003] 本發明針對現有技術的不足，提供了 一種潮間帶微小桿菌Exiguobacterium aestuariiCAMT25481，所述菌株具有降解T-2毒素的能力。
[0004] 本發明的另一目的在于提供上述菌株的應用。
[0005] 本發明的另一目的在于提供一種T-2毒素的降解劑。
[0006] 本發明的上述目的是通過以下技術方案予以實現的。
[0007] 一種潮間帶微小桿菌（Exiguobacteriumaestuarii)CAMT25481，所述菌株于2015 年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，菌種保藏號 為CGMCCNO. 11512。
[0008] 所述菌株CAMT25481的16srRNA的序列結果如SEQIDNO: 1所示。
[0009] 菌株CAMT25481的培養特性為：幼齡培養物為桿菌，老培養物為球狀，1. 1~ 1. 2μmX1. 4~3. 2μm，革蘭氏陽性；以周生鞭毛運動，兼性厭氧；在營養瓊脂上菌落平坦， 淡橙色，色素不擴散；不生孢，不抗酸，耐鹽；嗜堿，能在PH6. 5~11. 5生長；化能異養菌，發 酵代謝。
[0010] 菌株CAMT25481的生化性質：產β-葡萄糖苷酸酶、α-葡萄糖苷酶、吡咯烷基芳 胺酶、酪氨酸芳胺酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶，分解蔗糖、D-甘露醇，不產H2S。
[0011] 本發明還提供上述潮間帶微小桿菌（Exiguobacteriumaestuarii)CAMT25481在 降解T-2毒素中的應用。
[0012] 優選地，所述菌株CAMT25481的濃度為105-107CFU/mL。
[0013] 優選地，所述T-2毒素的濃度為15-25ng/mL。
[0014] 本發明還提供一種T-2毒素的降解劑：所述降解劑中含有105-107CFU/mL所述菌株 CAMT25481。
[0015] 與現有技術相比，本發明有益效果在于：菌株CAMT25481對T-2毒素降解率達 73. 80%，可有效降解T-2毒素，解決了飼料、原料蝦受T-2毒素污染無法利用，并嚴重污染 環境的重大問題，為確保原料蝦深加工產品的食品安全性奠定基礎。
【附圖說明】
[0016] 圖1為菌株CAMT25481的系統發育樹。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合說明書附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明，但實施例并不對 本發明做任何形式的限定。除非特別說明，本發明采用的試劑、方法和設備為本技術領域常 規試劑、方法和設備。
[0018] 實施例1T-2毒素降解微生物的分離純化
[0019] 傳統蝦醬的制備：市售鮮蝦經挑選后洗凈瀝干，打漿后加入蝦重30%的食鹽，攪 拌均勻后分成兩部分，一部分作為鮮蝦醬樣品，另一部分浸沒入發酵罐中進行自然發酵，日 曬夜露，每天攪拌2次，每次20min，發酵20d后作為發酵蝦醬樣品。
[0020] 分別取上述鮮蝦醬和發酵蝦醬樣品2. 00g，將兩批樣品均分為4組，分別加入0、 10、20、30ng的T-2毒素，在同等條件下進行微量發酵，在每組發酵ld、5d、10d、15d、20d后， 采用LC-MS/MS檢測發酵液中的T-2毒素殘留量。
[0021] T-2毒素的降解率（％ )=[(標準T-2毒素加入量-T-2毒素檢測濃度）/標準 T-2毒素加入量]X100%。
[0022] 選擇T-2毒素降解率最大的發酵液為目標樣本。10倍系列稀釋目標發酵液，取 lmL3個合適的連續稀釋度的樣液傾注營養瓊脂（NA)平板，每個稀釋度做2個平行，37°C培 養48h。計算菌落數量，觀察并記錄各菌落形態特征。根據菌落形態、大小、顏色、形狀等選 擇有代表性的單菌落，編號后用三段劃線法劃線，將平板倒置于30±1°C培養箱中恒溫培養 48h。革蘭氏染色鏡檢觀察，篩選出樣品中的優勢菌株為可能的降毒菌株，其中，將分離純化 得到一株菌株編號為CAMT25481。保存待用。
[0023] 實施例2分離的菌株的鑒定
[0024]將實施例1分離得到的菌株CAMT25481用VITEK2革蘭氏陰性細菌鑒定卡進行生 化特征分析，并參考《伯杰細菌鑒定手冊》。用16SrRNA分析方法對其進行系統發育分析及 菌種鑒定。
[0025] 菌株CAMT25481的培養特性為：幼齡培養物為桿菌，老培養物為球狀，1. 1~ 1. 2μmX1. 4~3. 2μm，革蘭氏陽性；以周生鞭毛運動，兼性厭氧；在營養瓊脂上菌落平坦， 淡橙色，色素不擴散；不生孢，不抗酸，耐鹽；嗜堿，能在PH6. 5~11. 5生長；化能異養菌，發 酵代謝。
[0026] 菌株CAMT25481的生化性質：產β-葡萄糖苷酸酶、α-葡萄糖苷酶、吡咯烷基芳 胺酶、酪氨酸芳胺酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶，分解蔗糖、D-甘露醇，不產H2S等；具 體見表1的鑒定結果。
[0027] 表1菌株CAMT25481的生化特性
[0028]
[0029]
[0030] 注：+為陽性，一為陰性
[0031] 菌株CAMT25481的16srRNA測序結果如SEQIDN0:1所示。將獲得的序列輸入 GenBank進行BLAST比對，將相似性相近的序列采用鄰接法進行聚類分析并構建系統發育 樹，結果見圖1。初步確定本發明菌株CAMT25481在分類學中的種、屬的位置，結果發現本發 明的菌株CAMT25481 與ExiguobacteriumaestuariiTF-16 相似性為 99%〇
[0032] 通過形態學特征、生理生化特性及16SrRNA序列分析，菌株CAMT25481鑒定為潮 間帶微小桿菌（Exiguobacteriumaestuarii)。將所述菌株保藏于中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期是2015年10月19日，菌種保藏號為CGMCC N0. 11512,所述菌株分類命名為潮間帶微小桿菌株Exiguobacteriumaestuarii。菌株的保 藏單位地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號。
[0033] 實施例3潮間帶微小桿菌CAMT25481對T-2毒素降解能力的測試
[0034] 將上述菌株CAMT25481的純培養物接種到含5、10、15、20、25ng/mLT-2毒素的營 養肉湯NB中，其中菌株CAMT25481的濃度為105-107CFU/mL;漩渦60s，于30±l°C、180r/ min全溫搖瓶柜中培養，72h后，分別吸取2mLNB增菌液于離心管中，加入2mL乙酸乙酯，漩 禍60s，超聲lOmin，取上層液于另一離心管中（如分層不明顯需在離心機下4000r/min離 心5min)，重復提取3次，合并提取液。將提取液在60°C氮吹儀下吹干。吸取2mL甲醇水溶 液（V/V: 3/7)溶解，漩渦30s，超聲5min。過0. 22μm濾膜，通過^：-13/^3檢測其中1'-2毒 素含量，記錄實驗數據。
[0035] 結果顯示，菌株0410'25481對濃度為5、10、15、20、25即/11^1'-2毒素降解率依次為 40. 27%，43· 56%，56· 19%，73· 80%，59· 41%。當T-2 毒素的濃度為 15-25ng/mL，所述菌株 CAMT25481降解能力較強，最高降解率可達73. 80%。
【主權項】
1. 一種潮間帶微小桿菌（ieri· aes toarii) CAMT25481，其特征在于， 所述菌株于2015年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，菌種保藏號為CGMCCNO.11512。2. 根據權利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株CAMT25481的16srRNA的序列 結果如SEQIDN0:1所示。3. 權利要求1所述的潮間帶微小桿菌（<36>6·??Λ3η7)0ΑΜΤ25481在降 解Τ-2毒素中的應用。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述菌株CAMT25481的濃度為10 5-107 CFU/mL〇5. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述T-2毒素的濃度為15-25ng/mL。6. -種T-2毒素的降解劑，其特征在于，所述降解劑中含有10 5-107CFU/mL權利要求1 所述菌株CAMT25481。
【專利摘要】本發明屬于微生物技術領域，具體公開了一種潮間帶微小桿菌及其應用。本發明菌株為潮間帶微小桿菌（<i>Exiguobacterium？aestuarii</i>）CAMT25481，所述菌株于2015年10月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），菌種保藏號為CGMCC？NO.？11512。菌株CAMT25481對T-2毒素降解率最高可達73.80%，可有效降解T-2毒素，解決了飼料、原料蝦受T-2毒素污染無法利用，并嚴重污染環境的重大問題，為確保原料蝦深加工產品的食品安全性奠定基礎。CGMCC NO. 1151220151019
【IPC分類】C12R1/01, A23L5/20, C12N1/20
【公開號】CN105349465
【申請號】CN201510861265
【發明人】王雅玲, 孫力軍, 謝主蘭, 劉穎, 黃正花
【申請人】廣東海洋大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月30日