一種從紫草中制備高純度紫草素的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種從紫草中制備高純度紫草素的方法。
【背景技術】
[0002]紫草，別名:硬紫草、軟紫草。是中國藥典收錄的草藥，藥用來源為紫草科植物新疆紫草、紫草或內蒙紫草的干燥根。紫草根中最重要的是紫草萘醌類化合物，主要包括紫草素，乙酰紫草素，β，β_ 二甲基丙烯酰紫草素，異戊酰紫草素，異丁酰紫草素等，其中β，β -二甲基丙烯酰紫草素含量最高，乙酰紫草素次之，紫草素含量最低。紫草萘醌類化合物已被美國國家癌癥研究所確定為具有抗腫瘤活性的物質，具有廣發的生物活性包括:抗菌、抗艾滋病、促進燒傷創口愈合、抗腫瘤等，備受研究者關注。紫草素是這類化合物的典型代表。
[0003]目前紫草素提取方法有超臨界C02萃取的方法、溶機溶劑提取法，其中超臨界C02萃取法設備成本高，較難工業化大生產，如公開號CN1334103A、CN1556087A等中國專利；溶機提取法紫草素收率低，雜質多，其他紫草素酯化衍生物無法利用；有專利報強堿水解法，如公開號CN103373913A、CN 1607199Α、CN 1607199 A的專利，實現了紫草素酯化衍生物水解轉化提取紫草素，但在強堿溶液中，處理時間過長，紫草素容易出現降解和異構化等問題，導致副產物多，純化難度加大，產品純度不高。因此近年來，高純度的紫草素價格依然很高，在我國中藥國際化戰略下，無法適應新藥開發和國際化推廣的需要。本發明要解決的問題是提供一種可以產業化從紫草中制備高純度紫草素的方法。
[0004]離子液體(1nic liquids)是指在室溫或接近室溫下呈現液態的、完全由陰陽離子所組成的液體。離子液體作為離子型化合物一般由有機陽離子和無機陰離子組成。由于離子液體本身所具有很多的物理和化學性質，與有機溶劑相比，離子液體獲得了 “綠色”溶劑的稱呼，被廣泛應用于催化化學、有機反應、高分子合成、有報道表明，以離子液作為介質，許多反應可取得較分子溶劑更好的結果，如:高的反應速率，好的選擇性，催化劑更溫和，可循環使用等。目前尚無文獻和專利報道利用離子液體催化水解紫草素(或異紫草素)酯類衍生物制備紫草素。
【發明內容】
[0005]為了克服現有技術問題，本發明的目的在于提供一種從紫草中制備高純度紫草素的方法。
[0006]本發明所述從紫草中制備高純度紫草素的方法，是在水解反應過程中，使用離子液體中和稀氨水組成的非均相為催化劑水解紫草提取物(主要成分為β，二甲基丙烯酰紫草素，異戊酰紫草素，異丁酰紫草素等紫草素酯化物)。該水解過程在低水比的條件下進行，用稀氨水弱堿替代了氫氧化鋰、氫氧化鈉等強堿，且具有較高的選擇性，能夠重復使用而且保持較高活性，副產物少，具有很強的工業應用前景。
[0007]本發明采用的技術方案為:
[0008]—種從紫草中制備高純度紫草素的方法，包括以下步驟:
[0009](I)提取:將紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，5?20°C下加4?12倍重量的60?90°C石油醚滲漉提取，35?45°C減壓濃縮回收石油醚，得到紫草石油醚提取物；
[0010](2)水解:將步驟(I)得到的紫草石油醚提取物投入4?10倍重量的離子液體中，添加0.5?2.5倍重量的稀氨水，在25?45°C下攪拌水解，控制轉速在50?200rpm，2?7h后水解完畢，水解后分離下層水解液，下層水解液加入0.2?5.0M硫酸中和至酸性，過濾得到紫草素粗品；
[0011](3)中壓硅膠柱層析:將步驟(2)得到的紫草素粗品，用乙酸乙酯溶解，硅膠拌樣，揮干乙酸乙酯，上中壓硅膠柱層析，石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脫，HPLC同步檢測，收集純度>90%的目標流份；
[0012](4)結晶:將純度>90%的目標流份減壓濃縮，放置結晶，真空干燥，得到針狀結晶，純度>98%。
[0013]所述步驟(2)中離子液體的陽離子為吡啶類離子、季銨類鹽離子、季鱗類鹽離子、咪唑類鹽離子中的一種。離子液陰離子為堿性或中性的陰離子=BF4，PF6，NO3，NO2，SO42，CH3COO，SbF6，ZnCl3，SnCl3，N (CF3SO2)2，N(C2F5SO2)2，N(FSO2)2，C (CF3SO2)3，CF3CO2，CF3SO3 ,CH3SO3中的一種。可以直接采用市售產品，如上海默尼化工科技有限公司生產的純度>99%的離子液體。
[0014]所述步驟(2)中離子液體加入重量與紫草石油醚提取物總重量比為(4?10);稀氨水的濃度為2?8% (v/v)。
[0015]所述步驟(3)中硅膠為300?500目，拌樣硅膠使用量為藥材重量的3?8%，柱徑高比為1: (7?15)，壓力控制在0.6?0.9MPa，石油醚-乙酸乙酯體積比為100: (5?30) ο
[0016]所述步驟(3)和步驟(4)中紫草素純度的檢測方法為反相高效液相色譜法(RP-HPLC) ο檢測條件:色譜柱為Lichrosorb C18柱(250_X4.6mm，5um);流動相為甲醇一水(體積比)=75:25 ;流速1.0ml/min ;檢測波長516nm ;進樣量10ul，柱溫:25°C。
[0017]本發明的積極效果為:本發明制備的紫草素素純度高、純度>98%，水解選擇性高、副產物少、制備量大，易于實現工業化生產。方法簡單、易于操作、成本低、水解過程在低水比的條件下進行，用稀氨水弱堿替代了氫氧化鋰、氫氧化鈉等強堿，且具有較高的選擇性，能夠重復使用而且保持較高活性，副產物少，具有很強的工業應用前景。
【具體實施方式】
[0018]下面結合具體實施例詳細說明本發明。
[0019]實施例1:
[0020](I)提取:將Ikg紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，5°C下加1kg的石油醚滲漉提取，35°C減壓濃縮回收石油醚，得到紫草石油醚提取物25g ;
[0021](2)水解:將步驟(I)得到的紫草石油醚提取物投入150g的離子液體1-乙烯基-3-丁基咪唑硝酸鹽(EM頂NO3)中，添加50g濃度為5% (v/v)的稀氨水，在25°C下攪拌水解，控制轉速在lOOrpm，5h后水解完畢，水解后分離下層水解液，下層水解液加入0.2M硫酸中和至酸性，過濾得到紫草素粗品16g ;
[0022](3)中壓硅膠柱層析:將步驟(2)得到的紫草素粗品，用50g乙酸乙酯溶解，硅膠拌樣，揮干乙酸乙酯，上300?500目中壓硅膠柱層析(柱徑高比為1:10)，依次用體積比100:5，100:25的石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脫，壓力控制在0.6?0.9MPa，HPLC同步檢測，收集純度>90 %的目標流份；；
[0023](4)結晶:將純度>90%的目標流份減壓濃縮，放置結晶，真空干燥，得到針狀結晶8.5g，純度為 98.4%。
[0024]實施例2:
[0025](I)提取:將Ikg紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，25°C下加8kg的石油醚滲漉提取，40°C減壓濃縮回收石油醚，得到紫草石油醚提取物22g ;
[0026](2)水解:將步驟(I)得到的紫草石油醚提取物投入200g的離子液體甲基咪唑六氟銻酸鹽(BM頂SbF6)中，添加50g濃度為4% (v/v)的稀氨水，在25°C下攪拌水解，控制轉速在90rpm，6h后水解完畢，水解后分離下層水解液，下層水解液加入0.2M硫酸中和至酸性，過濾得到紫草素粗品14g ;
[0027](3)中壓硅膠柱層析:將步驟(2)得到的紫草素粗品，用40g乙酸乙酯溶解，硅膠拌樣，揮干乙酸乙酯，上300?500目中壓硅膠柱層析(柱徑高比為1:12)，依次用體積比100:12，100:30的石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脫，壓力控制在0.6?0.9MPa，HPLC同步檢測，收集純度>90 %的目標流份；
[0028](4)結晶:將純度>90%的目標流份減壓濃縮，放置結晶，真空干燥，得到針狀結晶6.2g 純度為 98.6%o
[0029]實施例3:
[0030](I)提取:將Ikg紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，30°C下加8kg的石油醚滲漉提取，42°C減壓濃縮回收石油醚，得到紫草石油醚提取物18g ;
[0031](2)水解:將步驟⑴得到的紫草石油醚提取物投入120g的離子液體N-己基吡啶六氟磷酸鹽(HpyPF6)中，添加50g濃度為6% (v/v)的稀氨水，在25°C下攪拌水解，控制轉速在120rpm，6h后水解完畢，水解后分離下層水解液，下層水解液加入0.2M硫酸中和至酸性，過濾得到紫草素粗品12g ;
[0032](3)中壓硅膠柱層析:將步驟(2)得到的紫草素粗品，用36g乙酸乙酯溶解，硅膠拌樣，揮干乙酸乙酯，上300?500目中壓硅膠柱層析(柱徑高比為1:12)，依次用體積比100:5，100:30的石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脫，壓力控制在0.6?0.9MPa，HPLC同步檢測，收集純度>90 %的目標流份；
[0033](4)結晶:將純度>90%的目標流份減壓濃縮，放置結晶，真空干燥，得到針狀結晶5.6g 純度為 98.8%o
[0034]本發明按照上述實施例進行了說明，上述實施例不以任何形式限定本發明，凡采用等同替換或等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種從紫草中制備高純度紫草素的方法，其特征在于由以下步驟構成: (1)提取:將紫草粉碎至10?20目，置于提取柱，5?20°C下加4?12倍重量的60?90°C石油醚滲漉提取，35?45°C減壓濃縮回收石油醚，壓力為-0.09MP，得到紫草石油醚提取物； (2)水解:將步驟(1)得到的紫草石油醚提取物投入4?10倍重量的離子液體中，添加0.5?2.5倍重量的稀氨水，稀氨水的濃度為2?8% v/v,在25?45°C下攪拌水解，控制轉速在50?200rpm，2?7h后水解完畢，水解后分離下層水解液，下層水解液加入0.2?5.0M硫酸中和至酸性，過濾得到紫草素粗品； (3)中壓硅膠柱層析:將步驟(2)得到的紫草素粗品，用乙酸乙酯溶解，硅膠拌樣，揮干乙酸乙酯，上中壓硅膠柱層析，石油-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脫，HPLC同步檢測，收集純度>90 %的目標流份；所述硅膠為300?500目，拌樣硅膠使用量為藥材重量的3?8 %，柱徑高比為1:7?15，壓力控制在0.6?0.9MPa，石油醚-乙酸乙酯體積比為100:5?30 ； (4)結晶:將純度>90%的目標流份減壓濃縮，放置結晶，真空干燥，得到針狀結晶，純度>98%，減壓濃縮和真空干燥的壓力均為-0.09MPa。2.根據權利要求1所述的一種從紫草中制備高純度紫草素的方法，其特征在于，所述步驟(2)中離子液體的陽離子為吡啶類離子或季銨類鹽離子或季鱗類鹽離子或咪唑類鹽離子，離子液體的陰離子為堿性或中性的陰離子:BF4或PF 6或NO 3或NO 2或SO /或CH3C00 或 SbF 6 或 ZnCl 3或 SnCl 3或 N (CF 3S02)2 或 N (C 2F5S02)2 或 N (FS0 2)2 或 C (CF 3S02)3 或CF3C02 或 CF 3S03 或 CH 3S03。3.根據權利要求1所述的一種從紫草中制備高純度紫草素的方法，其特征在于，所述的離子液體重量與紫草石油醚提取物重量比為4?10:1。
【專利摘要】本發明屬于醫藥生物技術領域，具體涉及一種從紫草中制備高純度紫草素的方法。本發明所述制備方法為：將紫草粉碎，用60～90℃石油醚滲漉提取，將提取液濃縮，轉入離子液體中，添加一定比例的稀氨水進行水解2～7h。水解后分離下層水解液，加入0.2～5.0M硫酸中和至酸性，過濾得到紫草素粗品；再將上述紫草素粗品經中壓硅膠柱層析純化，目標流份濃縮結晶后，得到純度>98％的紫草素。本發明水解條件溫和，具有產率高，副產物少，后處理簡單的特點，可應用于工業化的大規模生產。
【IPC分類】C07C50/32, C07C46/10
【公開號】CN105348065
【申請號】CN201510881298
【發明人】楊永華, 楊永安
【申請人】南京大學
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年12月4日