一種連續生產γ-氨基丁酸的方法
【專利說明】-種連續生產Υ-氨基Τ酸的方法
[0001]
技術領域： 本發明屬于生物工程領域，具體地設及一種應用復合工程手段生產丫-氨基下酸的方 法。
[000引技術背景： 丫-氨基下酸（丫-Aminobutanoicacid,簡稱GABA)是一種在自然界廣泛分布的非 蛋白質氨基酸，分子量103. 1，烙點203°C。GABA介導神經系統內40%W上的抑制性神經傳 導，可通過突觸后膜超極化、減少離子內流和降低細胞代謝及氧消耗等機制，使突觸后神經 元處于保護性抑制狀態，并通過突觸前抑制減少谷氨酸釋放，提高神經元活力閣。關于GABA 生理功能的研究較多，如抗疲勞、降血壓、促睡眠等。
[0003]GABA因較好的生理功能和應用前景受到廣泛關注，并被應用于食品、醫藥和化妝 品中。日本厚生省、歐洲食品安全局（EFSA)和美國食品藥品管理局（抑A)承認乳酸菌發酵 生產的GABA為天然食品添加劑。2009年，中國衛生部批準此類GABA為新資源食品。天然 GABA已被應用到乳制品、軟飲料、巧克力、調味品、烘賠食品和酒飲料中。
[0004]GABA生產包括化學合成法、植物富集法和微生物合成法。化學合成的GABA有原 料殘留，因此安全性差，不能添加到食品中；植物中GABA含量低，富集提取成本較高；而微 生物合成GABA因安全性高、生產成本低和對環境友好更具開發價值。
[0005] 隨著基因工程技術的發展、工業微生物生物化學信息的增多、特別是工業生物載 體系統的成功構建，現在研究者開始用基因工程技術構建產γ-氨基下酸的菌種，為優良 的Τ-氨基下酸生產菌株的篩選提供了可靠的技術保障，但是工程菌發酵的性狀穩定性 差，在生產丫-氨基下酸過程中容易退化，且工程菌發酵工藝中原料濃度低，使得在工程菌 有效活力批次內，產物的產量和轉化率都較低。
[000引
【發明內容】
： 本發明的目的在于提供一種應用了有效整合發酵工程和酶工程的復合工程手段生產 丫-氨基下酸的方法，用W解決丫-氨基下酸發酵生產產量和產率較低的問題。
[0007] 本發明提供的丫 -氨基下酸的生產方法包括W下步驟： 一、大腸桿菌菌體的發酵 (1)發酵培養基的配制 甘油 20-60g/l，玉米漿 10. 0-30. 0g/l，棉巧蛋白粉 10. 0-30. 0g/l，KH2PO41.0-10.0g/l，1拆〇4 0.05-5.0邑/1，溶劑為水，充分溶解后，加入培養基質量0.01-1%的 乳糖或IPTG。
[000引（2)大腸桿菌的接種與增殖 無菌條件下，在發酵罐中，應用上述培養基接種大腸桿菌2-5% (體積質量比)，pH調節 至5-7,轉速5(K)r/min，然后，于35-39Γ下培養化。
[0009] (3)大腸桿菌的富集 大腸桿菌增殖化后，添加補加培養基并調控發酵參數來對大腸桿菌進行富集，補加培 養基組成(質量體積比)為：氨水20%~30%，甘油20-60%，乳糖或IPTG1-5%，溶劑為水；控制 參數為：溶氧不低于30%，發酵液中甘油含量維持在5~lOg/L。
[0010] 二、丫-氨基下酸的合成 (4) 大腸桿菌經富集后，當生物量達80~lOOg/L穩定時，停止攬拌，放出80-85%體積的 發酵液，對取出的發酵液用陶瓷膜進行過濾洗涂，得到的菌體進入W下反應體系中，該反應 體系依次加入憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘，使其濃度為：憐酸二氨鐘濃度5~lOg/l，憐酸氨二 鐘濃度3~8g/L。而后，將該反應體系加入到轉化罐中，并分批加入谷氨酸，使谷氨酸濃度維 持在22~50g/l，調節抑為4~6，將轉化罐升溫至30~45°C，通氣比為1:1，20化pm攬拌速度 下反應15小時后終止反應。
[0011] Ξ、大腸桿菌的連續發酵和丫-氨基下酸的連續合成 (5) 向步驟（4)取出發酵液后的發酵罐中，補入連續發酵培養基后，按照步驟（2)的工 藝參數繼續發酵，并且重復步驟（3)和（4) 4-9次后，終止發酵，得到共5-10次合成丫-氨 基下酸的轉化液。
[0012] 上述連續發酵培養基的質量百分比配置如下：甘油50-100g/l，玉米漿 10. 0-30. 0g/1,棉巧蛋白粉 10. 0-30. 0g/1,KH2PO41.0-10. 0g/l，1拆〇4 0.05-5. 0g/ L。
[0013] 本發明方法具有如下優點： (1)W玉米漿、棉巧蛋白粉為主要原料進行發酵，顯著降低了GABA的生產成本。
[0014] (2)菌種經過連續發酵，一次接種增殖，菌體重復利用生產，減少了菌種的制備，簡 化發酵的工藝，降低生產成本及勞動強度。
[0015] (3)菌種經過連續的發酵馴化，GABA的生產強度顯著提高，最終轉化液中GABA含 量達到 152-180g/L。
[0016] (4)本發明實現了GABA的連續生產，過程簡單，連續性強，便于工業放大生產。
[0017]
【具體實施方式】： 下面結合實施例對本發明提供的γ-氨基下酸的生產方法進行具體說明。
[001引實施例1 (1)按下述配方配制發酵培養基：甘油40g/l，玉米漿20.0g/l，棉巧蛋白粉20.0g/LKH2PO45.0g/l，1拆04 2.0邑/1，溶劑為水，充分溶解后，加入發酵培養基質量0.05%的 乳糖。
[0019] (2)大腸桿菌的接種與增殖 無菌條件下，在發酵罐中，應用上述培養基接種大腸桿菌3% (體積質量比)，抑調節至 6,轉速50化/min,然后，于37°C下培養化。
[0020] (3)大腸桿菌的富集 然后，添加補加培養基并調控發酵參數來對大腸桿菌進行富集，補加培養基組成為：氨 水25%，甘油40%，乳糖或IPTG1%，溶劑為水；控制參數為：溶氧不低于30%，發酵液中甘油 含量維持在7g/L。
[0021] (4) 丫-氨基下酸的合成 大腸桿菌經富集后，當生物量達90g/L穩定時，停止攬拌，放出80%體積的發酵液，對 取出的發酵液用陶瓷膜進行過濾洗涂，得到的菌體進入W下反應體系中，該反應體系依次 加入憐酸二氨鐘和憐酸氨二鐘，使其濃度為：憐酸二氨鐘濃度7g/l，憐酸氨二鐘濃度5g/L。 而后，將該反應體系加入到轉化罐中，并分批加入谷氨酸，使谷氨酸濃度維持在40g/l，調節pH為5,將轉化罐升溫至40°C，通氣比為1:1，200巧m攬拌速度下反應15小時后終止反應。
[0022] (5)大腸桿菌的連續發酵和丫-氨基下酸的連續合成 向步驟（4)取出發酵液后的發酵罐中，補入連續發酵培養基后，按照步驟（2)的工藝參 數繼續發酵，并且重復步驟（3)和（4) 9次后，終止發酵，得到共10次合成丫 -氨基下酸的 轉化液。
[0023] 上述連續發酵培養基的質量百分比配置如下：甘油70g/l，玉米漿20.0g/l，棉 巧蛋白粉 20. 0g/l，KH2PO45. 0g/l，1拆〇4 3. 0g/L。
[0024] 發酵結束后，檢測得轉化液中GABA的含量能達到180g/L。
[00幼 實施例2-5 與實施例1的方法相同，區別在于所用Ξ種培養基的組分和工藝參數，具體區別W及 所得最終轉化液GABA含量見表1 表1實施例2-5培養基組分、工藝參數與實施例1的區別及最終轉化液GABA含量
【主權項】
1. 一種連續生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步驟 (1) 大腸桿菌菌體的發酵； (2) γ-氨基丁酸的合成； (3) 大腸桿菌的連續發酵和γ-氨基丁酸的連續合成。2. 根據權利要求1所述的一種連續生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的步驟 (1) 大腸桿菌具體的發酵的具體步驟為： 發酵培養基的配制 甘油 20-60g/L，玉米漿 10. 0-30. 0g/L，棉籽蛋白粉 10. 0-30. 0g/L，ΚΗ2Ρ04 1.0-10.0g/L，MgS04 0 . 05-5 . 0g/L，溶劑為水，充分溶解后，加入培養基質量0.01-1%的 乳糖或IPTG; 大腸桿菌的接種與增殖 無菌條件下，在發酵罐中，應用上述培養基接種大腸桿菌2-5% (體積質量比)，pH調節 至5-7,轉速500r/min，然后，于35-39°C下培養5h; 大腸桿菌的富集 大腸桿菌增殖5h后，添加補加培養基并調控發酵參數來對大腸桿菌進行富集，補加培 養基組成(質量體積比)為：氨水20%~30%，甘油20-60%，乳糖或IPTG1-5%，溶劑為水；控制 參數為：溶氧不低于30%，發酵液中甘油含量維持在5~10g/L。3. 根據權利要求1所述的一種連續生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的步驟 (2) γ-氨基丁酸的合成的具體步驟為： 大腸桿菌經富集后，當生物量達80~100g/L穩定時，停止攪拌，放出80-85%體積的發酵 液，對取出的發酵液用陶瓷膜進行過濾洗滌，得到的菌體進入以下反應體系中，該反應體系 依次加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，使其濃度為：磷酸二氫鉀濃度5~10g/L，磷酸氫二鉀濃 度3~8g/L，而后，將該反應體系加入到轉化罐中，并分批加入谷氨酸，使谷氨酸濃度維持在 22~50g/L，調節pH為4~6，將轉化罐升溫至30~45°C，通氣比為1:1，200rpm攪拌速度下反 應15小時后終止反應。4. 根據權利要求1所述的一種連續生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的步驟 (3) 大腸桿菌的連續發酵和γ-氨基丁酸的連續合成的具體的步驟為： 向步驟（4)取出發酵液后的發酵罐中，補入連續發酵培養基后，按照步驟（2)的工藝參 數繼續發酵，并且重復步驟（3)和（4) 4-9次后，終止發酵，得到共5-10次合成γ-氨基丁 酸的轉化液。5. 根據權利要求4所述的一種連續生產γ-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的連續 培養基的組成為：甘油50-100g/L，玉米漿10. 0-30.0g/L，棉籽蛋白粉10. 0-30.0g/L， KH2P04 1. 0-10. 0g/L,MgS04 0 . 05-5 . 0g/L〇
【專利摘要】<b>本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種應用復合工程手段生產γ</b><b>-</b><b>氨基丁酸的方法，該方法包括步驟（</b><b>1</b><b>）大腸桿菌菌體的發酵；（</b><b>2</b><b>）γ</b><b>-</b><b>氨基丁酸的合成；（</b><b>3</b><b>）大腸桿菌的連續發酵和γ</b><b>-</b><b>氨基丁酸的連續合成，所得最終轉化液中</b><b>GABA</b><b>的濃度為</b><b>152-180g/L</b><b>。</b>
【IPC分類】C12R1/19, C12P13/00
【公開號】CN105331649
【申請號】CN201510724879
【發明人】劉建民, 高艷華, 高先嶺
【申請人】濟南國力生物科技有限公司
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月2日