;
[0054] (10)將過濾柱放置于干凈的2ml收集管中，加入400 μ 1 RWC Wash Buffer于室溫 下靜置5min ;然后在室溫下W速度1000化pm離屯、Imin ;
[00巧](11)棄濾液，將過濾柱放回到收集管內，并加入500 μ 1 RNA Wash BufferII;然 后在室溫下W速度10000巧m離屯、Imin ;所述RNA Wash BufferII在使用前用48ml的無水 乙醇稀釋；
[005引重復步驟（11)操作一次，然后空轉2min;
[0057] (13)將過濾柱轉移至純凈的1. 5ml離屯、管內，加入40μ1DEPC水溶解RNA;
[005引 （14)室溫下，靜置5min;
[005引（巧）室溫下，1000化pm離屯、Imin，即可得到RNA，用核酸快速測定儀和瓊脂糖凝膠 電泳測濃度與純度。
[0060] 2、使用伯樂公司的LandM-MLVRTKit(cDNA第一鏈的合成試劑盒）進行cDNA第 一鏈的合成（RT-PCR)
[00川 （1)在RNase-化ee的PCR管中配置下列溶液：
[0062] 5 X IScript reaction mix 4 μ 1
[0063]含 1μgRNA的溶液 xμ1
[0064] IScript reverse transcriptase 1 μ 1
[0065] Nuclease-free water補齊至20μ1 ;所述X《15 ;
[006引 似將步驟（1)所得溶液吹打均勻，置于PCR中，WW下條件進行反轉錄擴增： 25°C反轉錄引物和模板RNA退火結合5min，42°C延伸30min，85°C保持5min把合成的cDNA和RNA變性打開得到cDNA，然后4°C恒溫保存。
[0067] 3、JcSUTl、JcSUT3、JcSUT4cDNA的擴增：
[0068] 根據諾禾致源公司提供的轉錄組序列，運用prime巧.0設計JcSUTscDNA擴增引 物，并在上海生物工程公司合成引物。應用如SEQIDN0:1所示的引物F，如SEQIDN0:2 所示的引物3，進行反轉錄？〔1?擴增1〇51]1'1;應用如560 10^:3所示的引物尸，如560 10 N0:4所示的引物R，進行反轉錄PCR擴增JcSUT2 ;應用如SEQIDN0:5所示的引物F，如SEQ IDNO:6所示的引物R，進行反轉錄PCR擴增JcSUT3。引物序列如表1所示：
[006引表1引物序列列表
[0070]
[00川 （1)在滅菌的0. 2血離屯、管加入下列試劑如下：
[0072] Buffer 25ul 濃化為2.5nmol·L-1 的dNTP 10μ] cDNA第一鏈模板 玄μ1 Primer-FI，度μ1 Primer-民 1 5μL KOI) FX 1 μ1 d("-l2〇 9μΙ。
[007引似PCR反應條件是：94°C預變性2min，98 °C變性lOsec，55 °C退火30sec，68 °C延伸 2min，將變性、退火和延伸Ξ個步驟重復35個循環；循環結束后，68°C再延伸7min，4°C冷卻lOmin;反應后加 3μ1dNTPs、0. 5μ1Taq酶，72°C反應 20min。
[0074] (3)PCR反應的產物電泳結果：
[007引如圖1所示，其中1、2均為JcSUTl的cDNAPCR產物條帶。
[007引如圖2所示，其中1、2均為JcSUT3的cDNAPCR產物條帶。
[0077] 如圖3所示，其中1、2均為JcSUT4的cDNAPCR產物條帶。
[0078] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因的克隆方法，其特征在于包括以下操作步驟： 應用如SEQ ID N0:1所示的引物F，如SEQ ID N0:2所示的引物R，進行反轉錄PCR擴增 JcSUTl;應用如SEQ ID N0:3所示的引物F，如SEQ ID N0:4所示的引物R，進行反轉錄PCR 擴增JcSUT3 ;應用如SEQ ID NO :5所示的引物F，如SEQ ID NO :6所示的引物R，進行反轉 錄 PCR 擴增 JcSUT4。2. 根據權利要求1所述的一種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因的克隆方法，其特征在 于：所述PCR的反應條件是：94°C預變性2min，98°C變性10sec，55°C退火30sec，68°C延伸 2min，將變性、退火和延伸三個步驟重復35個循環；循環結束后，68°C再延伸7min，4°C冷卻 lOmin ;反應后加 3 μ 1 dNTPs、0. 5 μ 1 Taq 酶，72°C反應 20min。3. 根據權利要求1所述的一種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因的克隆方法，其特征在 于：所述PCR的體系是：4. 根據權利要求3所述的一種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因的克隆方法，其特征在 于：所述cDNA第一鏈模板是按照以下方法合成： (1)在RNase-free的PCR管中配置下列溶液： 5 XIScript reaction mix 4 μ 1 含1 μ g RNA的溶液 x μ 1 IScript reverse transcriptase 1 μ 1 Nuclease-free water 補齊至 20 μ 1 ;所述 x < 15 ; ⑵將步驟⑴所得溶液吹打均勾，置于PCR中，以以下條件進行反轉錄擴增：25°C反 轉錄引物和模板RNA退火結合5min，42°C延伸30min，85°C保持5min把合成的cDNA和RNA 變性打開得到cDNA，然后4°C恒溫保存。5. 根據權利要求4所述的一種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因的克隆方法，其特征在 于：所述RNA是按照以下提取方法得到： (1) 收集l〇〇mg冰凍的小桐子樣品在離心管中，在組織解凍之前，加入500 μ 1的Buffer RCL和β -巰基乙醇的混合液，渦旋震蕩30s，使樣品充分混勻；所述Buffer RCL和β -巰 基乙醇的體積比為1 :50 ; (2) 55°C金屬浴1~3min ;接著室溫下以速度14000rpm離心5min ; (3) 將上清液轉移到含有gDNA過濾柱的2ml收集管中，并在室溫下以速度14000rpm離 心 2min ; (4) 加入相等體積的Buffer RCB到下清液中，并通過移液器吸打混合液5~10次，使 之充分混勻； (5) 將步驟（4)中所得的混合液吸取一半加入到含有一個HiBind@RNA Min的過濾柱的 2ml收集管中，并在室溫下以速度lOOOOrpm離心lmin ;離心后棄濾液，并將過濾柱放回到收 集管中； (6) 將步驟（4)中剩余混合液加入到過濾柱中，并在室溫下以速度lOOOOrpm離心 lmin ;離心后棄濾液，并將過濾柱放回到收集管中； (7) 加入300 μ 1 RWC Wash Buffer至過濾柱，在室溫下以速度lOOOOrpm離心lmin ; (8) 棄濾液，加入75μ1 Dnase digestion反應液至過濾柱中央濾膜上；所述Dnase digestion 是將 OBI Dnasel Digestion Buffer 73. 5 μ 1 和 RNase-free Dnase I 1. 5 μ 1 顛倒混勻而成的混合液； (9) 室溫下，靜置15min ; (10) 將過濾柱放置于干凈的2ml收集管中，加入400 μ 1 RWC Wash Buffer于室溫下靜 置5min ;然后在室溫下以速度lOOOOrpm離心lmin ; (11) 棄濾液，將過濾柱放回到收集管內，并加入500 μ 1 RNA Wash Buffer II ;然后在 室溫下以速度lOOOOrpm離心lmin ;所述RNA Wash Buffer II在使用前用48ml的無水乙醇 稀釋； (12) 重復步驟（11)操作一次，然后空轉2min ; (13) 將過濾柱轉移至純凈的1. 5ml離心管內，加入40 μ 1 DEPC水溶解RNA ; (14) 室溫下，靜置5min ; (15) 室溫下，lOOOOrpm離心lmin，即可得到RNA，用核酸快速測定儀和瓊脂糖凝膠電泳 測濃度與純度。6. -種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因 JcSUTl，其特征在于：由權利要求1所述的克隆 方法獲得，所述的小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因 JcSUTl的核苷酸基因序列如SEQ ID NO :7 所示。7. -種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因 JcSUT3,其特征在于：由權利要求1所述的克隆 方法獲得，所述的小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因 JcSUT3的核苷酸基因序列如SEQ ID NO :8 所示。8. -種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因 JcSUT4,其特征在于：由權利要求1所述的克隆 方法獲得，所述的小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因 JcSUT4的核苷酸基因序列如SEQ ID NO :9 所示。
【專利摘要】本發明屬于分子生物學及基因工程技術領域，公開了一種小桐子蔗糖轉運蛋白同源基因(JcSUT1,JcSUT3,JcSUT4)的克隆方法。克隆方法包括以下操作步驟：應用如SEQ？ID？NO：1所示的引物F，如SEQ？ID？NO：2所示的引物R，進行反轉錄PCR擴增JcSUT1；應用如SEQ？ID？NO：3所示的引物F，如SEQ？ID？NO：4所示的引物R，進行反轉錄PCR擴增JcSUT3；應用如SEQ？ID？NO：5所示的引物F，如SEQ？ID？NO：6所示的引物R，進行反轉錄PCR擴增JcSUT4。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/29
【公開號】CN105331618
【申請號】CN201510787042
【發明人】彭昌操, 楊紫薇, 劉思雯, 韓鴻均, 劉應波, 任陳希, 白雪
【申請人】華南農業大學
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月16日