四環素誘導型人工MicroRNA元件的制作方法
【技術領域】
[0001] 本申請設及膀脫癌檢測治療領域。
【背景技術】
[0002]RNA干擾（RNAinterference,RNAi)被譽為20世紀十大科學發現之一，是由微 RNAOnicroRNA)誘導的同源mRNA的降解過程，可使基因表達受到抑制。基于微RNA的RNA 干擾治療可能會是一種更加安全有效的腫瘤治療手段。但是，使用天然的微RNA容易出現 祀基因有限、體內易降解、藥效時間短、易引發干擾素反應等缺點。
[0003] 人工microRNA是W天然microRNA前體短發夾結構為基本骨架，將天然microiRNA 的功能序列替換為人工設計的祀向基因的反義序列，而得到的與天然microRNA具有相同 結構、但與天然microRNA祀向序列完全無關的人工microRNA。人工microRNA通常由表達 性載體經過轉錄和加工生成，其生成機制和作用途徑與天然microRNA相同。相對于天然 microRNA,人工microRNA具有表達成本低、干擾效率高、持續時間長和毒性低等優點。四環 素開關系統基因表達系統是新近發展起來的高效、無毒、具有嚴密開關功能的基因表達系 統，自推出W來，在很多方面得到了廣泛的應用，尤其是在基因的表達調控及基因治療上。
[0004] 隨著合成生物學運一新興學科的迅猛發展，W及合成生物學的工程原理與技術的 不斷成熟，從而使開展高效的、定量可控的RNA干擾腫瘤治療成為可能。
【發明內容】
[0005] 本發明提供一種新的人工MicroRNA元件。
[0006] 本發明提供一種四環素誘導型人工MicroRNA元件，其核巧酸序列如SEQNO: 1或 沈QNO: 2所示。
[0007] 人工MicroRNA元件可W針對不同的膀脫癌細胞系的祀向基因，如β-catenin基 因，此時，序列如SEQNO:1所示；也可W如HIF-1α基因，此時，序列如SEQNO:2所示。
[0008] -種所述的元件在制備抑制膀脫癌細胞系中β-catenin基因表達的試劑中的應 用，所述核巧酸序列如SEQNO: 1所示。
[0009] -種所述的元件在制備抑制膀脫癌細胞系中HIF-1α基因表達的試劑中的應用， 所述核巧酸序列如SEQNO:2所示。
[0010] 祀向基因在膀脫癌細胞系中高表達，通過上述人工元件，可W有效抑制該祀向基 因的表達。
[0011] 一種所述的元件在制備抑制膀脫癌細胞遷移的藥物中的應用。
[0012] 所述膀脫癌細胞為T24和5637。
[0013] 一種所述的元件在制備促進膀脫癌細胞調亡的藥物中的應用。
[0014] 一種非治療方法的促進膀脫癌細胞調亡的方法，用所述的元件轉染所述膀脫癌細 胞。
[0015] 一種所述的元件在制備治療膀脫癌的藥物中的應用。
[0016] 一種所述的元件在膀脫癌細胞中調控祀向基因表達的應用。
[0017] 所述勒1向基因是HIF-1α基因和β-catenin基因。
[0018] 本發明的有益效果是：該人工元件可W有效抑制膀脫癌細胞系中祀向基因的表 達，可W有效抑制膀脫癌細胞的增殖，促進膀脫癌細胞的調亡，抑制膀脫癌細胞的遷移，從 而為治療膀脫癌提供了可能性。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本實施方式四環素誘導型人工MicroRNA元件的構建示意圖；
[0020] 圖2是顯示本實施方式四環素誘導型人工MicroRNA元件能夠定量可控的抑制對 相關癌基因的表達的結果圖，A、B、C、D部分中，由左至右的五個方柱分別表示0. 0μg/ml Dox、0.lμg/mlDox、0. 5μg/mlDox、2μg/mlDox、10μg/mlDox；
[0021] 圖3是顯示本實施方式四環素誘導型人工MicroRNA元件能夠有效抑制其革己向 基因下祀游基因的表達的結果圖，A、B部分中，由左至右的四個方柱分別表示NC值OX-)、 NC值OX+)、β-catenin值οχ-)、β-catenin值OX+) ;C、D部分中，由左至右的四個方柱分別 表示NC值OX-)、NC值OX+)、HIF-1α值OX-)、HIF-1α值OX+);
[0022] 圖4是顯示本實施方式四環素誘導型人工MicroRNA元件有效抑制膀脫癌細胞增 殖的結果圖；
[0023] 圖5是顯示本實施方式四環素誘導型人工MicroRNA元件有效誘導膀脫癌 細胞調亡的結果圖，E、F部分中，由左至右的四個方柱分別表示NC值ox-)、NC值OX+)、 β -catenin值OX-)(或HIF-1 α值OX-))、β -catenin值OX+)(或HIF-1 α值OX+));
[0024] 圖6是顯示本實施方式四環素誘導型人工MicroRNA元件對膀脫癌細胞遷移運 動能力的抑制的結果圖，最下方左側由左至右的四個方柱分別表示NC值ox-)、NC值OX+)、 β -catenin值OX-)、β -catenin值OX+);最下方右側由左至右的四個方柱分別表示 NC值OX-)、NC值OX+)、HIF-1 α值OX-)、HIF-1 α值OX+)。
【具體實施方式】
[00巧]技術與方法 [002引 1.細胞培養
[0027]膀脫癌細胞系Τ24 和 5637 購自AmericanTypeQiltureCollection(ATCC， Manassas,USA)，細胞培養液由 90 % 的DMEM(Invitrogen，CA)，10 % 的胎牛血清 (Invitrogen)，1% -2%的谷氨酷胺和0. 5% -1%的雙抗配成。
[0028] 2.四環素誘導型人工MicroRNA元件的構建
[0029]W天然的MicroRNA-30為基本骨架，將成熟MicroRNA的功能序列替換為所選取 祀基因的干擾序列，從而得到特定祀基因的人工MicroRNA。同時，為了使轉錄后的人工 MicroRNA能夠被更加準確有效的加工與修飾，在設計的人工MicroRNA兩端加入了一種名 為RGR的核酶序列。轉錄后的核酶RGR片段可經過自我剪切修飾，幫助其中間的目的片段 形成有效的空間結構。接下來將構建好的人工MicroRNA導入到四環素誘導型質粒內，從而 得到了能產生四環素誘導型人工MicroRNA的合成元件。
[0030] 3.細胞轉染
[0031] 轉染前一天，4-5ΧΙΟ4個細胞接種在24孔板上，加入0. 5ml培養基，放在37°C、5% C〇2培養箱內。生長24小時后，細胞匯合度達到70%，在50ul的無血清培養基內加入lug 重組質粒，柔和混勻。在50ul無血清培養基內加入lulLipofectamin2000(Invit;rogen， CA)試劑，輕輕混勻，室溫放置5min。將稀釋好的質粒和Lipo2000輕柔混勻，室溫放置20分 鐘，W便形成質粒^ipofectamin復合物。將質粒/lipofectamin混合物加入24孔板內， 輕柔搖晃24孔板。放入培養箱內，4-6小時后更換培養基，48小時后收集細胞，準備下一步 實驗。
[0032] 4.總RNA提取
[0033] 使用美國nvitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA。使用紫外分光光度計和2% 瓊脂糖凝膠檢測提取的總RNA質量。定量后于-80°C儲存備用。
[0034] 5.實時定量PCR
[003引實時定量PCR檢測選用U6(snRNAU6)作為內源對照基因。使用All-in-化eTM miRNAqRT-PCRDetectionKit(GeneCopoieaInc,MD,USA)進行實時逆轉錄合成cDNA 和定量PCR驗證。先進行miRNA逆轉錄合成cDNA。逆轉錄反應體系為總RNA1μ1， 2. 5U/μ1PolyAPolymerase1μ1,RTaseMix1μ1，5χReactionbuffer5μ1,dd 肥0(RNase-/面asefree)17yl。瞬時離屯、，37°C解育 60min，然后，85°C酶滅活 5min。實 時定量PCR總反應體系為 20μ1，包括 10μ1 2xAll-in-0neTMqPCRMix, 2μ1Universal AdaptorPCRPrimer(2μM), 2μ1All-in-OneTMqPCRPrimer(2μM), 2μ1First-Strand cDNA(dilutedin1:5), 50xROXReferenceDye0.4μ1和3.6μ1雙蒸水。使用ABIPRISM 7000Fluorescent如antitativePCRSystem(AppliedBiosystems，CA，USA)進行qPCR 反應和分析。PCR反應均設3個重復。PCR反應參數如下：（1)95°C預變性15min; (2)40個 循環，每循環包括95°Cxl5s，55°Cx20s，70°Cx30s0All-in-0neTMmiRNAqPCRPrimer貨 號為：has-miR-210,血iRQP0317 ;snRNAU6,血iRQP9001。取3個重復的中值計算相對miRNA 表達量（ACt=Ctmedianm測A-Ctmedian遍J。表達倍數用2 & &G端。
[003引 6.細胞增殖檢測
[0037]使用CellCountingKit(CCK-S)，即 2-(2-甲氧基-4-硝苯基）-3-(4-硝苯 基）-5-(2, 4-二橫基苯）-2H-四挫單鋼鹽檢測細胞增殖。用含10%胎小牛血清的培養液配 成單個細胞懸液，W每孔5000個細胞接種到96孔板，每孔體積200μ1。分別于轉染后24， 48和72h，取相應的孔做檢測。每個樣本設3個復孔。每孔加CCK-8溶液巧mg/ml) 10μ1。 解育比，終止培養。選擇450nm波長，用酶標儀度io-Rad，