一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法。
【背景技術】
[0002] 目前，在蛋白質酶解方面存在著蛋白質酶解敏感性低、蛋白水解不徹底等的瓶頸 及核心問題，嚴重制約了酶解技術在蛋白質加工中的應用。為了提高蛋白質的酶解效果，通 常在酶解前進行適當的變性處理（如熱變性處理），通過改變蛋白質的空間結構，使之更易 于與酶結合，從而改善酶解特性。但是，劇烈的處理方式會影響酶解產物功能活性肽的生物 活性及儲藏特性，而超高壓技術作為近二十幾年來新興的一項食品非熱加工技術，其特點 是在保持制品營養成分和風味的前提下，延長制品的貯藏期、提高安全性、改善組織結構， 尤其在改變蛋白質特性、調節酶活力方面有著突出的優勢，是一種有效的處理手段。部分學 者已對其進行了系統的研究，如Heremans K和Belloque J等研究發現，高壓處理可通過影 響蛋白質三級、四級結構的非共價鍵氫鍵、離子鍵和疏水鍵等，使蛋白類酶的結構伸展而變 得松散，從而暴露出更多結合位點，易于酶解反應的進行；Morild E.等研究表明，較低壓力 (< 200MPa壓力下，保壓10~20min)處理可使蛋白類酶活性中心發生凝聚作用，其原因可 能是壓力改變了形成酶活性中心基礎的蛋白質三級結構，使得完整組織中經常被隔離的酶 和基質相接觸，從而加速酶促反應。
[0003] 然而，目前國內外學者在高壓處理對酶解反應影響的研究大多集中在蛋白質方 面，而在高壓處理對酶活性影響機理方面的研究報道較少。有鑒于此，本發明以胃蛋白酶為 高壓處理對象，用高壓處理后的胃蛋白酶水解酪蛋白，測定了高壓處理后的胃蛋白酶酶活 力及其水解酪蛋白產物的水解度，研究了高壓處理對胃蛋白酶酶解特性的影響，以期為進 一步探索超高壓促進胃蛋白酶酶解的機理打下基礎。
[0004] 目前還沒有高壓處理提高胃蛋白酶活力方法的專利公開，人們希望發明出高壓處 理提高胃蛋白酶活力的方法，實現提高胃蛋白酶活力的目的。
【發明內容】
[0005] 本發明一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，包括以下步驟：
[0006] 第一步酶溶液的制備稱取定量胃蛋白酶溶于pH 1.5的鹽酸溶液，使濃度達到 2mg/mL，4°C冷藏，lh內迅速完成高壓處理。
[0007] 第二步高壓處理將制備的酶溶液經真空包裝，隨后置于高壓處理設備中，于 20°C下，進行lOOMPa壓力下保壓10-20min的處理。
[0008] 第三步保存將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0009] 通過本發明的一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，使胃蛋白酶活力提高了 29 %以上，胃蛋白酶活力顯著提高，實現了提高胃蛋白酶活力的目的。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發明不同壓力對胃蛋白酶酶活力及酶解產物水解度影響圖；
[0011] 圖2是本發明不同保壓時間對胃蛋白酶酶活力及酶解產物水解度影響圖；
【具體實施方式】
[0012] 實施例1 :
[0013] 第一步酶溶液的制備稱取10g胃蛋白酶溶于pH 1.5的鹽酸溶液，使濃度達到 2mg/mL，總體積為5升的胃蛋白酶溶液，在4°C下冷藏。
[0014] 第二步將制備好的胃蛋白酶溶液立即真空包裝，然后置于高壓處理設備中，于 20°C下，進行lOOMPa壓力下保壓15min的處理。
[0015] 第三步將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0016] 實施例2:
[0017] 第一步酶溶液的制備稱取2g胃蛋白酶溶于pH 1. 5的鹽酸溶液，使濃度達到 2mg/mL，總體積為1升的胃蛋白酶溶液，在4°C下冷藏。
[0018] 第二步將制備好的胃蛋白酶溶液立即真空包裝，然后置于高壓處理設備中，于 20°C下，進行lOOMPa壓力下保壓20min的處理。
[0019] 第三步將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
[0020] 以上列舉的僅是本發明的具體實施例，顯然本發明不限于以上實施例，還可以有 其他變形。
[0021] 下面結合科學實驗對本發明的效果進一步說明。
[0022] 1試驗材料與設備
[0023] 1. 1胃蛋白酶：上海晶純生化科技股份有限公司，酶活力1 : 15000 ;酪蛋白：北京 索萊寶科技有限公司；牛血清白蛋白：北京賽為思生物技術開發中心；L-酪氨酸：北京奧博 星生物技術有限責任公司。主要試劑：甲醛，三（羥甲基）氨基甲烷，乙二胺四乙酸二鈉，甘 氨酸，尿素，5, 5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸，三氯乙酸，1-苯胺基-8-萘磺酸，鐵氰化鉀，三氯 化鐵，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，無水乙醇，鄰苯三酚，鄰二氮菲，硫酸亞鐵，雙氧水等，實 驗中所用其他化學試劑均為分析純。
[0024] 1. 2試驗設備
[0025] UHPF_750MPa型超高壓處理裝置：包頭科發新型高科技食品機械有限公司，工 作壓力600MPa，功率5KW);多功能真空包裝機：山東省諸城市中鼎機械；SHA-C數顯水浴 恒溫振蕩器：江蘇省金壇市華峰儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠； KjelteCTM8400全自動凱氏定氮儀：丹麥福斯FOSS Denmark ;TU-1810型紫外分光光度 計：北京普析通用儀器有限責任公司；Cary Fluorescence焚光分光光度計：美國安捷 倫Agilent ;MULTIFUGE XIR型冷凍離心機：德國Thermo ;ALPHA1-2LD型冷凍干燥機：德 國Christ German ;Model 270凝膠色譜儀：英國Malvern ;高效液相色譜儀：美國Waters 600 ;電泳儀：美國Bio-RAD。
[0026] 2試驗方法
[0027] 2. 1酶溶液：在測定前，稱取定量胃蛋白酶溶于pH 1. 5的鹽酸溶液，使濃度達到 2mg/mL，4°C冷藏，lh內迅速完成高壓處理。
[0028] 2. 2超高壓處理
[0029] 將制備的酶溶液經真空包裝（vacuum-packed)，隨后置于高壓處理設備中，于 20°(：下，進行50、100、150、20010^壓力下保壓2〇11^11的處理，確定最佳壓力；
[0030] 在最佳壓力下進行5、10、15、20min保壓處理，確定最佳高壓處理時間；
[0031] 以未經高壓處理（常壓0.1 MPa)的樣液作為對照。
[0032] 2. 3酶解反應
[0033] 高壓處理后的酶溶液中加定量酪蛋白，使酪蛋白濃度達到10mg/mL，酶濃度 1. 75mg/mL，調pHl. 5、于57°C恒溫水浴振蕩器中酶解4h。酶解結束后沸水浴滅酶lOmin，冷 卻至室溫，4°C冷藏，測定各指標。
[0034] 3.測定指標
[0035] 3.1胃蛋白酶活力測定
[0036] 依據SB/T 10317-1999,采用福林酚法（folin-phenol method)測定胃蛋白酶酶 活力。酶活力單位的定義：在50°C條件下，lmin水解1克酪蛋白產生1 μ g酪氨酸定義為1 個酶活力單位（U)。
[0037] 3. 2酶解液水解度的測定
[0038] 采用甲醛滴定法，取蛋白酶解液5mL置于100mL容量瓶中，定容、混勻后取20mL置 于200mL燒杯中，加入60mL去0)2水，用0. 05mol/L標準NaOH溶液滴定至pH 8. 2。加入 10mL甲醛溶液，混勻后再用0. 05mol/L標準NaOH溶液繼續滴定至pH 9. 2,同時用蒸餾水代 替酶解液做空白對照。記錄所消耗的標準NaOH溶液的體積，計算水解度（DH)。
[0040] 式中，c為標準NaOH溶液濃度，mol/L A為樣品消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體 積，mL ;V2為試劑空白消耗氫氧化鈉標準滴定溶液的體積，mL ;V3為試劑稀釋液取用量，為 lmL(5mL酶解液定容100mL后取用20mL) ;S為底物濃度；W為樣品中蛋白質含量，本實驗所 用酷蛋白樣品中蛋白質含量為87. 34% ;htot為蛋白質中妝鍵總數mmol/g，酷蛋白中妝鍵 總數為 8. 2 X 10 3mmol/g。
[0041] 4實驗結果
[0042] 4. 1不同壓力對酶活力及酶解產物水解度的影響
[0043] 不同壓力處理的胃蛋白酶活力及對應處理組（圖1中壓力為OMPa)酶解酪蛋白的 水解度變化情況見圖1。由圖可知，與未加壓處理樣品相比，lOOMPa的壓力處理可顯著增 強胃蛋白酶活力（P < 〇. 05)，使水解酪蛋白所得產物的水解度顯著提高（p < 0. 05)，且在 lOOMPa時酶活力及水解度達到最高，酶活力及水解度分別從空白樣的16. 5X 104u、8. 23% 提高到21. 86X 104u、11. 25%，分別提高了 32. 48%和36. 70%，之后隨壓力增加迅速下降；
[0044] 4. 2不同保壓時間對酶活力及酶解產物水解度的影響
[0045] 不同保壓時間處理的胃蛋白酶活力及對應處理組（圖2中保壓時間為Omin)酶解 酪蛋白的水解度變化情況見圖2。在lOOMPa壓力下，隨保壓時間的延長，胃蛋白酶活力及 酶解物的水解度均顯著提高（P < 〇. 05)。故lOOMPa，10-20min的壓力處理可顯著改善胃 蛋白酶活力及該酶水解酪蛋白的能力。在保壓15min時，酶活力及水解度分別從空白樣的 12. 52X 104u、8. 23%提高到 21. 36X 104u、ll. 02%，分別提高了 29. 45%和 33. 90%。
【主權項】
1.本發明一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，其特征在于： (1) 酶溶液的制備：稱取定量胃蛋白酶溶于pHl. 5的鹽酸溶液，使濃度達到2mg/mL，4°C 冷藏，lh內迅速完成高壓處理。 (2) 高壓處理：將制備的酶溶液經真空包裝，隨后置于高壓處理設備中，于20°C下，進 行lOOMPa壓力下保壓10-20min的處理。 (3) 保存：將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1°C下冷藏保存。
【專利摘要】本發明一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法。稱取定量胃蛋白酶溶于pH？1.5的鹽酸溶液，使濃度達到2mg/mL，4℃冷藏，1h內迅速完成高壓處理。將制備的酶溶液經真空包裝，隨后置于高壓處理設備中，于20℃下，進行100MPa壓力下保壓10-20min的處理。將高壓處理后的胃蛋白酶溶液在1℃下冷藏保存。通過本發明的一種高壓處理提高胃蛋白酶活力的方法，使胃蛋白酶活力提高了29％以上，胃蛋白酶活力顯著提高，實現提高胃蛋白酶活力的目的。
【IPC分類】C12N9/48
【公開號】CN105316305
【申請號】CN201510827332
【發明人】馬漢軍, 劉本國, 康壯麗, 李斌, 白騰輝
【申請人】河南科技學院
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月17日