一株無蘋果酸副產的l-天冬氨酸酶重組大腸桿菌及其構建方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一株無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶 重組大腸桿菌及其構建方法與應用。
【背景技術】
[0002] L-天冬氨酸在醫藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。在醫藥方面，是氨基酸制 劑的主要成分；在化工方面，可以作為制造合成樹脂的原料，大量用于合成環保材料聚天門 冬氨酸；尤其在食品工業方面，L-天門冬氨酸是一種良好的營養增補劑，也是糖代用品阿 斯巴甜的主要生產原料。具有良好的市場前景。
[0003] 目前L-天冬氨酸主要以富馬酸為原料，采用生物酶法合成。由于采用全細胞或是 細胞破碎后的粗酶液進行轉化，因此轉化體系中含有兩種可以催化富馬酸的酶，即富馬酸 酶和L-天冬氨酸酶，前者催化富馬酸合成蘋果酸，后者催化富馬酸合成L-天冬氨酸。副產 物蘋果酸的合成不僅降低了目標產物的轉化率，同時也增加了下游產物分離純化的難度。 因此構建一株具有高活性的L-天冬氨酸酶活性且無富馬酸酶活性或低富馬酸沒活性的重 組菌可有效降低L-天冬氨酸生產過程成本。
【發明內容】
[0004] 本發明要求解決的技術問題是，提供一株無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組大 腸桿菌。
[0005] 本發明還要解決的技術問題是，提供上述無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組大 腸桿菌的制備方法。
[0006] 本發明最后要解決的技術問題是，提供上述無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組 大腸桿菌在制備L-天冬氨酸中的應用。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：
[0008] -株無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，將耐銨型大腸桿菌BEW308 中編碼富馬酸酶的基因 fumA、fumB、fumC中的一個或幾個基因失活，再將編碼L-天冬氨 酸酶基因插入到編碼富馬酸酶fumAC基因的位置，即得到無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸 酶重組大腸桿菌，所述的大腸桿菌耐銨型大腸桿菌BEW308,該菌株的保藏號為CCTCC N0 : M2013157。所述的CCTCC N0:M2013157菌株為一株銨根離子耐受型大腸桿菌，該菌株的具 體信息在申請號為201310279778. 6專利中已經公開。fumA和fumC這兩個基因在基因組上 是相連的。fumA、fumB、fumC 的基因的 EcoGene 登記號分別為 EG10356，EG10357，EG10358。
[0009] 其中，所述的編碼L-天冬氨酸酶基因其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0010] 其中，所述編碼L-天冬氨酸酶基因，其起始密碼子的上游有一段信號肽，該信號 肽的核苷酸序列如SEQ ID N0 :2所示。
[0011] 上述的無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌的制備方法，包括如下步 驟：
[0012] (1)將pKD46質粒轉入耐銨型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽性轉化子大腸桿菌 BEW308-pKD46,利用L-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將大腸桿菌BEW308-pKD46制備 成感受態細胞；
[0013] (2)以PIJ773質粒為模板，SEQ ID Ν0 :3和SEQ ID Ν0 :4所示的序列為引物，PCR 擴增得到fumB基因敲除片段；
[0014] (3)將步驟（2)得到的fumB基因敲除片段電轉化至大腸桿菌BEW308-pKD46制備 成感受態細胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子；
[0015] (4)將步驟（3)得到的陽性重組子制備成感受態細胞，將pCP20質粒轉化其中， 42°C誘導FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗 性的平板上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株為fumB基因失活的菌株 BEW308- Δ fumB ；
[0016] (5)人工合成在SEQ ID NO :1起始密碼子ATG前添加了 SEQ ID NO : 2所示核苷酸 序列的基因敲除片段；（6)將步驟（4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308- Λ fumB制備 成感受態細胞，將PKD46質粒轉化其中，利用L-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將其制 備成感受態細胞；
[0017] (7)將步驟（5)中的核苷酸序列轉化至步驟(6)的含有λ重組酶的感受態細胞 中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子；
[0018] (8)將步驟（8)中的陽性重組子制備成感受態細胞，將pCP20質粒轉化將pCP20質 粒轉化其中，42°C誘導FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑 實驗，在物抗性的平板上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株即為無蘋果 酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌BEW308- Λ fumB- Λ fumAC-aspC。
[0019] 上述無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌在生產L-天冬氨酸中的應用 在本發明的保護范圍之內。
[0020] 其中，利用無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌發酵產L-天冬氨酸酶， 再利用L-天冬氨酸酶發酵液催化富馬酸氨轉化為L-天冬氨酸。
[0021] 其中，所述的發酵產L-天冬氨酸酶，其發酵培養基配方為：酵母粉24g/L，蛋白胨 10g/L，K2HP0436mmol/L，MgS0410mmol/L，微量元素[CaCl 2. 6H20 0· 74g/L，ZnS04. 7H20 0· 18g/ L，MnS04. H20 20g/L，Na2. EDTA20. lg/L，CuS040. lg/L，C0C120. 104g/L, FeS04. 7H20 2g/L]2mL/ L，溶劑為水，pH用NaOH調到7. 2~7. 5。
[0022] 其中，所述的發酵產L-天冬氨酸酶，其發酵過程中，溫度為28~30°C，pH為7. 2~ 7. 8,溶氧為5~40%。
[0023] 其中，利用L-天冬氨酸酶發酵液催化富馬酸氨轉化為L-天冬氨酸的條件為：溫度 30~37°C，轉速為100~200r/min，反應時間為12~24小時。
[0024] 其中，利用發酵液催化富馬酸氨轉化為L-天冬氨酸，催化體系中富馬酸的濃度為 150 ~200g/L。
[0025] 有益效果：
[0026] (1)本發明可實現L-天冬氨酸酶的組成型高活性表達，且發酵培養后獲得的細胞 或是粗酶液具有低富馬酸酶活性。
[0027] (2)微有氧培養該重組菌，將其游離細胞或是簡單凍溶后的粗酶液與富馬酸銨混 合后，其轉化產物中主要是L-天冬氨酸（底物的摩爾轉化率超過99. 5% )，無蘋果酸積累。 該方法可有效提高底物富馬酸的轉化收率，降低副產物的生產，有效降低生產成本。
【附圖說明】
[0028] 圖1敲除fumB基因的線性片段PCR圖，泳道Μ為marker，泳道1為線性片段
[0029] 圖2菌落PCR鑒定圖，其中BEW308泳道為出發菌株，Μ為Marker，1~8為鑒定的 單菌落。
【具體實施方式】
[0030] 根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本 發明。
[0031] 實施例1 :
[0032] 本實施例說明利用同源重組技術敲除親本耐銨型大腸桿菌BEW308中富馬酸酶 fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過程。
[0033] (1)利用LB培養基，于37°C、有氧條件下培養大腸桿菌BEW308至0D6QQ= 0· 4~ 0.6,制備成電轉感受態；
[0034] (2)將重組質粒電轉入感受態的大腸桿菌BEW308。電擊條件為：200 Ω，25 μ F，電 擊電壓2. 3kv，電擊時間4~5ms。電擊后迅速將菌體加入預冷lmL的S0C培養基，150r/ min、30°C培養lh之后涂布于帶氨節青霉素（amp)的LB培養基平板篩選出陽性轉化子 BEW308 (pKD46)；
[0035] (3)在LB培養基中加入10mM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導質粒pKD46表達出λ 重組酶，制成電轉感受態；
[0036] (4)以兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統， 以質粒PIJ773為模板，并設計兩端帶有fumB同源片段的擴增引物，擴增出線性DNA同源片 段，引物序列如下：
[0037] 上游帶同源臂引物H1-P1(SEQ ID N0:3):
[0038] 5 ' -CGGCACGCCATTTTCGAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTCCGGGGATCCGTCGA CC-3'
[0039] 下游帶同源臂引物H2-P2(SEQ ID N0:4):
[0040] 5 ' -TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAATGTAGGCTGGAGCTGCT TC-3'
[0041] 反應體系：帶同源臂的上下游引物（lOOpmol/ μ 1)各0· 5 μ 1 ;模板DNA(100ng/ μ 1)0. 5 μ 1 ； 10 Xbuffer 5 μ 1 ；dNTPs(10mM) 1 μ 1 ；DMS0(100% ) 2. 5 μ 1 ；Pyrobest DNA 聚合酶（2· 5U/ μ 1) 1 μ 1 ;ddH20 36/35. 5 μ 1 ;總體積 50 μ 1。
[0042] 反應條件：94 °C，2min ;(94 °C，45sec ;50 °C，45sec ;72 °C，90sec ;10 個循環）； (94°C，45sec ;55°C，45sec ;72°C，90sec ;15 個循環）；72°C，5min〇
[0043] 線性DNA片段的鑒定如圖1。
[0044] (5)電轉線