一種嗜熱芽胞桿菌菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種嗜熱芽孢桿菌及其應用，尤其發現一種新的高產高溫耐堿過氧化氫酶酶(CGTase)菌株嗜熱芽胞桿菌菌株CHB12以及應用該菌株發酵生產過氧化氫酶酶，屬于發酵生產領域。
【背景技術】
[0002]過氧化氫酶(Catalase，簡稱CAT，EC1.11.1.6)，又稱觸酶，是一種高效催化分解過氧化氫的酶，存在于幾乎所有的好氧生物和一部分厭氧生物中。它能夠催化h202分解為H20和02，使過氧化氫不至于與超氧化物自由基反應生成有害的.0Η ;并對血紅蛋白及其它的含巰基蛋白質起到保護作用，使它們不被氧化，因此對減輕活性氧損傷有一定意義。廣泛應用于食品，醫藥，紡織，造紙，橡膠，臨床，美容等行業。
[0003]自20世紀80年代以來，紡織，造紙及其它工業已經開始使用過氧化氫代替有毒的氯氣來漂白和消毒產品。而殘余過氧化氫的去除也是生產過程中必不可少的。近年來，世界各國處于對環境和安全問題考慮，過氧化氫酶作為一種清除劑逐漸替代化學試劑降解過氧化氫，市場對過氧化氫酶的需求也呈大幅增長趨勢。目前，商業化的過氧化氫酶主要來源于動物肝臟和微生物。但動物來源酶的生產通常受多種因素影響，易污染，熱穩定性也較差，微生物過氧化氫酶具有來源范圍廣，易培養，生產周期短，價格便宜，可大規模生產等優點，已成為目前研究的熱點。紡織和造紙工業中的高溫高堿環境限制了一些常規過氧化氫酶的應用，嗜熱耐堿過氧化氫酶是紡織和印染工業中清除過氧化氫的理想選擇。本發明人發現一株產高溫耐堿過氧化氫酶的菌株，且通過液體發酵得到過氧化氫酶酶液，該酶液可以高效清除溶液中的過氧化氫。基于以上發現提出了本發明。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種嗜熱芽孢桿菌及其應用，該菌株為嗜熱芽孢桿菌(Geobacillus caldoxylosilyticu) CHB12，該菌株于2015年1月23日于中國典型培養物菌種保藏中心登記保藏，地址為武漢大學，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015063。且用該菌株發酵生成過氧化氫酶粗酶液，應用該酶液可以在10°C?90°C，pH 7-11條件下分解過氧化氫。
[0005]本發明是通過以下技術方案實施的:
首先實驗室以自主分離菌株Geobacillus caldoxylosilyticus CHB1為出發菌株，在培養過程中篩選出源于該菌株的高產過氧化氫酶的自發突變株，該突變菌株保藏于中國典型培養物菌種保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M 2015063。
[0006]用所述嗜熱芽胞桿菌菌株CHB12發酵生產過氧化氫酶酶液的具體步驟為:
(1)嗜熱芽胞桿菌菌株CHB12的活化:用接種環將嗜熱芽胞桿菌菌株CHB12劃線于菌株活化培養基上，并于丨旦溫培養箱中培養18 h?24 h，并且培養溫度為55 °C?60 °C ；
(2)制備種子液:將步驟(1)所獲得的嗜熱芽胞桿菌菌株CHB12的單菌落接種于50mL的種子培養基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養18 h?24 h，溫度50°C?60°C，轉速180rpm ；
(3)發酵粗酶液:按2%移種量將步驟(2)所獲得的種子液轉入已消毒滅菌的產酶培養基中培養，溫度45 °C?55°C，轉速180 rpm，培養時間為18~30 h ；
(4)過氧化氫酶粗酶液的制備:將步驟(3)所獲得的液體發酵液細胞破碎后10000 g超速離心10 min，上清即為粗酶液；
酶活力單位定義為每分鐘分解1 μmol過氧化氫所需的酶量。測定時底物濃度為10mM的過氧化氫，分解速率用UV800型紫外可見分光光度計在240 nm處測定吸光度。
[0007]所述菌種活化培養基的組分:牛肉浸膏0.5~2 %，大豆蛋白胨0.5~2 %，磷酸氫二鉀0.1 ~1%，磷酸二氫鉀0.05-0.5%，瓊脂粉1.6 %，蒸餾水配制1000mL，pH 7.2 ；
所述種子培養基的組分:牛肉浸膏0.5~2 %，大豆蛋白胨0.5~2 %，磷酸氫二鉀0.1-1%,磷酸二氫鉀 0.05-0.5 %，蒸餾水配制 1000mL，pH 7.2 ；
所述產酶培養基的組分:糊精0.5-2 %，牛肉膏0.1-0.5 %，大豆蛋白胨0.5-2 %，CaCl20.2 %，K2HP04 0.2 %，ΚΗ2Ρ04 0.2 %，MgS04.7H20 0.1%，FeS04 0.2 %，蒸餾水配制 lOOOmL，pH 7.0。
[0008]本發明的有益效果:本發明提供了一株嗜熱芽胞桿菌CHB12，以此菌株做為發酵菌株，以糊精、牛肉膏和大豆蛋白胨等組成產酶培養基，發酵獲得高溫耐堿過氧化氫酶酶液。所獲過氧化氫酶酶活可達4541 U/mL，可以在堿性環境中和叫寬泛的溫度范圍內分解過氧化氫。本發明所提供的菌株在紡織造紙工業等需要酶法除去過氧化氫的工序中有很好的應用潛力。
【附圖說明】
[0009]圖1 CHB12平板菌落及革蘭氏染色形態(X 1000)。
[0010]圖2 CHB12細胞表面形態結構。左圖X17000，右圖X40000。
[0011 ] 圖3過氧化氫酶酶液最適反應溫度。
[0012]圖4過氧化氫酶酶液最適反應pH。
【具體實施方式】
[0013]實施例1
所述菌株分離自福建永泰溫泉水樣，將水樣涂布于過氧化氫酶選擇性培養基上，培養24 h，形成單菌落，點滴3%的H202于單菌落及周圍，根據產氣泡速度和強度進行篩選，從中選擇產氣速度較快的菌株；挑取少量培養18 h的CHB12斜面菌苔進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察菌體形態、測量菌體大小；將CHB12菌株涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，55°C培養24 h后，觀察菌落特征；將活化的CHB12菌種制成菌懸液，吸取一滴菌懸液滴于有膜支撐的銅網上，用一定濃度的醋酸鈾染色固定，置于日光燈下烘干，透射電鏡觀察CHB12細胞表面形態，細胞呈直桿狀，常以成對或鏈狀排列，具圓端，以周生鞭毛運動，細胞染色呈現革蘭氏陽性。
[0014]實施例2
用接種環將嗜熱芽胞桿菌CHB12劃線于菌株活化培養基上，并于恒溫培養箱中培養18h，并且培養溫度為55°C;從斜面挑取一環菌落接種于50 mL種子培養基中，60°C 180 rpm搖床培養18 h即為種子液。以2%的接種量轉接種子于50 mL發酵培養基，50°C，180 rpm搖床培養20 ho將發酵液超聲破碎后4°C，10000 g超速離心10 min。在最適反應溫度70°C測定酶活力為4541 U/mL。
[0015]實施例3
用接種環將嗜熱芽胞桿菌CHB12劃線于菌株活化培養基上，并于恒溫培養箱中培養24 h，并且培養溫度為60°C ;從斜面挑取一環菌落接種于50 mL種子培養基中，60°C 180rpm搖床培養18 h即為種子液。以2%的接種量轉接種子于50 mL發酵培養基，60°C，180rpm搖床培養16 h。將發酵液超聲破碎后4°C，10000 g超速離心10 min。在最適反應溫度70°C測定酶活力為2900 U/mL。應用該菌株制備的酶液可以在寬溫度范圍(10~90°C )，PH7-11范圍內高效分解過氧化氫。
[0016]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種嗜熱芽胞桿菌菌株，其特征在于:所述菌株為嗜熱芽胞桿菌(Geobacilluscaldoxylosilyticus) CHB12，該菌株已于2015年1月23日在中國典型培養物菌種保藏中心登記保藏，保藏編號為CCTCC NO:M 2015063。2.一種如權利要求1所述嗜熱芽胞桿菌菌株的應用，其特征在于:該菌株用于發酵生產過氧化氫酶。3.根據權利要求2所述的一種嗜熱芽胞桿菌菌株應用，其特征在于:其制備方法的具體步驟為: (1)嗜熱芽胞桿菌CHB12的活化:用接種環將嗜熱芽胞桿菌CHB12劃線于菌株活化培養基上，并于丨旦溫培養箱中培養18 h?24 h，并且培養溫度為55 °C?60 °C ； (2)制備種子液:將步驟(1)所獲得的嗜熱芽胞桿菌菌株CHB12的單菌落接種于50mL的種子培養基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養18 h?24 h，溫度50~55°C，轉速180rpm ； (3)發酵粗酶液:按2%移種量將步驟(2)所獲得的種子液轉入已消毒滅菌的產酶培養基中培養，溫度45 °C?55°C，轉速180 rpm，培養時間為18~30 h ； (4)過氧化氫酶酶液的制備:將步驟(3)所獲得的液體發酵液細胞破碎后，10000g超速離心10 min，上清即為粗酶液。4.根據權利要求3所述一種嗜熱芽胞桿菌的應用，其特征在于:所述菌種活化培養基的組分:牛肉浸膏0.5~2 %，大豆蛋白胨0.5~2 %，磷酸氫二鉀0.1 ~1%，磷酸二氫鉀.0.05-0.5%，瓊脂粉 1.6 %，蒸餾水配制 1000mL，pH 7.2 ； 所述種子培養基的組分:牛肉浸膏0.5~2 %，大豆蛋白胨0.5~2 %，磷酸氫二鉀0.1-1%,磷酸二氫鉀 0.05-0.5 %，蒸餾水配制 1000mL，pH 7.2 ； 所述產酶培養基的組分:糊精0.5-2 %，牛肉膏0.1-0.5 %，大豆蛋白胨0.5-2 %，CaCl2.0.2 %，K2HP04 0.2 %，ΚΗ2Ρ04 0.2 %，MgS04.7H20 0.1%，FeS04 0.2 %，蒸餾水配制 1000mL，pH.7.0。
【專利摘要】本發明涉及一種嗜熱芽胞桿菌菌株及應用該菌株發酵生產過氧化氫酶。該菌株為菌株Geobacillus？caldoxylosilyticus？的自發突變株，該菌株已于2015年1月23日在中國典型培養物菌種保藏中心登記保藏，保藏號為CCTCC？NO：M？2015063，經液體深層發酵后可得高溫耐堿過氧化氫酶，最適反應條件下測得酶活可達4541？U/mL。該高溫耐堿過氧化氫酶可用于高溫堿性生產環境中過氧化氫的清除。CCTCC NO：M 201506320150123
【IPC分類】C12N9/08, C12N1/20, C12R1/01
【公開號】CN105316262
【申請號】CN201510826024
【發明人】林新堅, 陳濟琛, 賈憲波, 陳龍軍
【申請人】福建省農業科學院土壤肥料研究所
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年12月30日