一種aqp基因3′-utr及其在控制基因表達(dá)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及AQP基因mRNA的3’ -UTR在調(diào)控基因表達(dá)中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]植物基因表達(dá)過程分為啟動(dòng)子的啟動(dòng)、轉(zhuǎn)錄起始、延伸及終止。基因的啟動(dòng)需要啟動(dòng)子，同樣，基因表達(dá)的終止也需要可靠的終止子。基因工程在很大程度上有賴于基因轉(zhuǎn)錄的有效啟動(dòng)和終止。真核生物中，轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程在空間和時(shí)間上是分開進(jìn)行的，轉(zhuǎn)錄過程中的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控都是十分重要的。一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的總體結(jié)構(gòu)是由 5’端非翻譯區(qū)(5，untranslated reg1n，5’-UTR)、編碼區(qū)(open reading frame，ORF)和3’端非翻譯區(qū)(3，-UTR)三部分組成。3’端非翻譯區(qū)(3，untranslated reg1n，3’ -UTR)是真核生物特有的序列結(jié)構(gòu)之一，3’ -UTR通過影響mRNA的積累、穩(wěn)定性和翻譯效率，在調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平中起到重要作用。目前植物基因工程中常用的終止子是Tnos，除此以外其他的終止子很少，尋找可替代Tnos的終止子對(duì)于植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。
[0003]水通道蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的、普遍存在于動(dòng)物、植物及微生物生物膜中的一類特異的水分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞膜上組成“孔道”，可控制水在細(xì)胞的進(jìn)出，通過水通道蛋白實(shí)現(xiàn)的水分快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞伸長(zhǎng)和分化、果實(shí)成熟及種子萌發(fā)以及非生物脅迫應(yīng)答等多種生理過程有關(guān)。前期研究顯示，水通道蛋白大量存在于參與水分、離子集流的細(xì)胞中，這些細(xì)胞往往是正在分裂和伸長(zhǎng)的細(xì)胞及幼嫩部位，如表皮細(xì)胞、幼穗以及正在發(fā)育的根和芽等。其分布表現(xiàn)出明顯的器官、組織和細(xì)胞特異性。是一種組成型表達(dá)基因，又具有組織特異表達(dá)特性。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供AQP基因mRNA的3’ -UTR及在調(diào)控基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
所述AQP基因3’ -UTR，基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，其是將編碼AQP的3’ -UTR的核苷酸序列與報(bào)告基因⑶S序列重組，獲得⑶S-AQP 3’ -UTR的重組基因，然后整合至宿主基因組中，并隨宿主基因組表達(dá)。具體為:依據(jù)AQP基因mRNA 3’ -UTR的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列F:5’ AGCGAGCTCGAGCCTCGTTCAAGTGGTG 3’，R:5’ ACCGGAATTCAGTTTTCAATACCTTTCA 3’，以“日本晴” DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的條帶，回收純化后，與載體PMD-18T連接測(cè)序。載體pCUb1-GUS -Tnos用EcoR I和Sac I雙酶切，將AQP基因3’_UTR片段替換Tnos形成重組質(zhì)粒pCUb1-GUS-AQP3’ -UTR，酶切鑒定。將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程包括:
1)種子消毒和愈傷誘導(dǎo)； 2)農(nóng)桿菌pCUb1-GUS-AQPl 3’ -UTR/LBA4404 制備；
3)侵染及共培養(yǎng)；
4)抗性愈傷篩選；
5)抗性愈傷分化、幼苗生根。
[0007]轉(zhuǎn)基因小苗移栽、檢測(cè)、篩選出超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，通過自交重組，獲得轉(zhuǎn)基因純合株系。
[0008]種植T1代水稻，分別取轉(zhuǎn)基因純合株系花期根、莖、葉、花器官以及成熟種子。部分用于組織化學(xué)法檢測(cè)樣品GUS蛋白(JefferSonl987);部分用于提取蛋白測(cè)定總蛋白含量和GUS酶活性。
[0009]所述宿主為水稻。
[0010]所述編碼AQP的3’ -UTR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1，以及該序列替換、缺失或添加若干個(gè)核苷酸形成的具有與AQP的3’ -UTR同等功能的核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明提供的AQP的3’ -UTR片段可替代Tnos，作為基因表達(dá)調(diào)控序列，可應(yīng)用于植物基因工程。特別是水稻的基因工程修飾，利用來源于水稻自身的序列培育轉(zhuǎn)基因水稻，能夠避免使用外源調(diào)控序列帶來的安全隱患。
【附圖說明】
[0012]圖1 AQP基因3' -UTR核苷酸序列連接在⑶S表達(dá)載體pCUb1-GUS-AQP 3’ -UTR上的表達(dá)框示意圖。
[0013]圖2轉(zhuǎn)基因水稻不同組織器官⑶S組織化學(xué)染色圖。其中A、B、C、D、E分別為根、莖、葉、花和種子。U3為轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-AQP 3’ -UTR載體水稻；UT為轉(zhuǎn)pCUb1-GUS_Tnos水稻，作為陽性對(duì)照；CK為非轉(zhuǎn)基因水稻，為陰性對(duì)照。
[0014]圖3轉(zhuǎn)基因水稻⑶S蛋白酶活性檢測(cè)法驗(yàn)證AQP 3 ’ -UTR在轉(zhuǎn)基因水稻上的功能。其中⑶S-AQP 3’ -UTR 為轉(zhuǎn) pCUb1-GUS-AQP 3’ -UTR 載體水稻；CK 為轉(zhuǎn) pCUb1-GUS_Tnos 水稻，作為陽性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不限于本發(fā)明的范圍。
[0016]實(shí)施例1 AQP基因mRNA的3’ UTR的克隆及序列分析
以“日本晴”水稻為材料，采用改進(jìn)的CTAB法(Sambrook et al，1989)提取基因組DNA的提取。以“日本晴”水稻DNA為模板，依據(jù)AQP基因mRNA 3’ -UTR對(duì)應(yīng)的DNA序列，用Primer5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為 F:5’ AGCGAGCTCGAGCCTCGTTCAAGTGGTG 3’，R:5’ACCGGAATTCAGTTTTCAATACCTTTCA 3’。用 Golden DNA Polymerase 擴(kuò)增目的片段，PCR 反應(yīng)體系(50ul)為:“日本晴”水稻 DNA 2uL，F(xiàn) 和 R 引物各 luL,Golden DNA Polymerase (2.5U/uL) luL，2xReact1n Mix 25uL，最后用滅菌的ddH20補(bǔ)齊至50uL，目的片段大小322bp，電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，正確后用1%瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收3’ -UTR片段，與載體PMD-18T連接轉(zhuǎn)化后送生物公司測(cè)序，序列如SEQ ID N0.1所示。序列分析顯示AQP基因mRNA的3’ -UTR含有6個(gè)多聚信號(hào)元件。
[0017]實(shí)施例2 pCUb1-GUS-AQPl 3’ _UTR植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因水稻獲得
用限制性內(nèi)切酶 Hind III和 BamH I 將載體骨架 pCXGUS-P (genebank ID: FJ905224)(Chen S.et al., 2009)酶切回收，與Ubiquitin啟動(dòng)子片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCUb1-GUS-Tnos。再用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sac I雙酶切重組質(zhì)粒pCUb1-GUS_Tnos，用AQP 3’ -UTR片段替換pCUb1-GUS-Tnos中的Tnos，所構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCUb1-GUS-AQP3’ -UTR,將該質(zhì)粒電擊到農(nóng)桿菌LBA4404菌株，鑒定正確后，用于轉(zhuǎn)化水稻，鑒定AQP3’-UTR的功能。所構(gòu)載體的表達(dá)框示意圖見圖1。
[0018]將pCUb1-GUS-AQP 3’ UTR重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入“日本晴”水稻，所獲轉(zhuǎn)化植株經(jīng)30mg/L潮霉素篩選、PCR檢測(cè)鑒定為轉(zhuǎn)基因植株后，種植于溫室中，T0代水稻自交后，收獲T1代種子。
[0019]實(shí)施例3⑶S組織化學(xué)染色法驗(yàn)證AQP 3’ UTR在轉(zhuǎn)基因水稻上的功能
選T1代純合株系水稻，于開花期分別取根、莖、葉、花器官，成熟期取種子縱切，保留完整的胚和胚乳。采用組織化學(xué)法檢測(cè)樣品⑶S蛋白(Jefferson，1987)表達(dá)。具體步驟如下:將待測(cè)樣品侵入⑶S反應(yīng)液中，37°C保溫?cái)?shù)小時(shí)，然后用無水乙醇、75%乙醇和50%乙醇對(duì)葉片組織進(jìn)行梯度脫色處理，拍照記錄⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-AQP 3’_UTR載體的水稻其⑶S蛋白表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-Tnos的水稻，且在植株的不同部位均有較強(qiáng)表達(dá)。
[0020]實(shí)施例4⑶S蛋白酶活性檢測(cè)法驗(yàn)證AQP 3’ -UTR在轉(zhuǎn)基因水稻上的功能
選T1代純合株系，于開花期分別取根、莖、葉、花器官，成熟期取種子縱切，保留完整的胚和胚乳，提取總蛋白。每個(gè)克隆取3株作為混合樣。用Bradford法(1976)測(cè)定總蛋白含量。用熒光法測(cè)定GUS酶活性。具體步驟為:取一塊96微孔板預(yù)冷，每孔加入50ul的待測(cè)樣品后，迅速加入50ul預(yù)冷的GUS檢測(cè)緩沖液(2mM 4-MU溶于提取緩沖液中，提取緩沖液的成分為:(50mM NaHP04 (磷酸緩沖液)ΡΗ7.0，10mM 2-mercaptoethanol, 10mM Na2EDTA，
0.1% sodium lauryl sarcosine,0.1% Triton X-100 )，密封。于 37°C保溫反應(yīng) 45 分鐘，之后迅速加入900ul 0.2M的反Carbonate stop buffer (0.2M Na2C03)終止反應(yīng)。用Thermo Scientific公司的焚光測(cè)量?jī)x，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為355nm、發(fā)射波長(zhǎng)為460nm的濾光片組，掃描方式為終點(diǎn)測(cè)定，收集記錄熒光強(qiáng)度，空白陰性對(duì)照為不加任何樣品的空白孔。將機(jī)器掃描獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合樣品總蛋白測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算GUS酶活性。GUS酶活力單位定義為單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量的GUS酶蛋白催化產(chǎn)生的具有熒光活性的4-MU的摩爾數(shù)，具體為每分鐘每毫克GUS酶蛋白催化所產(chǎn)生的4-MU的皮摩爾數(shù)(即pmol/mg/min)。所有材料的GUS酶活性數(shù)據(jù)換算成標(biāo)準(zhǔn)的酶活力單位，根據(jù)不同的酶活力單位來判斷GUS基因在組織中的表達(dá)水平，結(jié)果見圖3。檢測(cè)結(jié)果顯示??轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-AQPl 3’ -UTR載體的水稻其⑶S蛋白酶活性明顯高于轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-Tnos的水稻，且在植株的根、莖、葉、花器官以及成熟種子中均有較強(qiáng)表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.AQP基因3’ -UTR，其特征在于:所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。2.一種如權(quán)利要求1所述AQP基因3’ -UTR在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)中的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所編碼的AQP基因3’-UTR的核苷酸序列整合到宿主基因組中，隨宿主基因組表達(dá)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:其是將編碼AQP基因3’-UTR的核苷酸序列整合在宿主基因組中目的基因的3’端。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述宿主為水稻。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:具體步驟為:依據(jù)AQP基因3’-UTR的 DNA 序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列 F: 5 ’ AGCGAGCTCGAGCCTCGTTCAAGTGGTG 3 ’，R: 5 ’ACCGGAATTCAGTTTTCAATACCTTTCA 3’，以水稻DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的條帶，回收純化后，與載體PMD-18T連接測(cè)序；載體pCUb1-GUS -Tnos用EcoR I和Sac I雙酶切，用將AQP基因3’ -UTR片段替換Tnos形成重組質(zhì)粒pCUb1-GUS_AQP3’ -UTR，酶切鑒定；將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程包括: 1)種子消毒和愈傷誘導(dǎo)； 2)農(nóng)桿菌pCUb1-GUS-AQPl 3' -UTR/LBA4404 制備； 3)侵染及共培養(yǎng)； 4)抗性愈傷篩選； 5)抗性愈傷分化、幼苗生根。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，提供了AQP基因3’-UTR及其在控制基因表達(dá)中的應(yīng)用，AQP基因3’-UTR序列如SEQ？ID？NO.1所示，是將編碼AQP基因3’-UTR的核苷酸序列與報(bào)告基因GUS重組后，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其整合到植物細(xì)胞中，隨宿主基因組表達(dá)。帶有3’-UTR的GUS與帶有Tnos的GUS相比，蛋白產(chǎn)物顯著增加。本發(fā)明還提供了AQP基因3’-UTR在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N15/82, C12N15/113, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105296485
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510739204
【發(fā)明人】蘇軍, 管其龍, 李剛, 林智敏, 胡太蛟, 顏靜宛
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月4日