一種多標簽抗原及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及免疫印跡領域，尤其設及一種多標簽抗原及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 免疫印跡技術是將蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進行檢測的技術。對已知表 達蛋白，可用相應抗體作為一抗進行檢測，對新基因的表達產物，可通過融合部分的抗體檢 ，具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優點，是檢測蛋白質特性、表達與分布的一種 最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、多膚分子的質量測定及病毒的抗體或抗原檢 測等，因此免疫印跡技術在分子生物學研究中具有廣泛的應用。
[0003] 在設計表達一種蛋白時，通常都會進行融合蛋白表達，即在蛋白質序列的N端或 者C端加入常用的標簽序列，如6地is、Flag、Myc等。在做免疫印跡檢測目的蛋白表達量時 通常只需檢測目的蛋白上加入的標簽序列即可，即用6*化S、Flag、Myc等標簽單抗與目的 蛋白抗原進行免疫印跡反應，檢測出的信號強弱即反應出目的蛋白表達量的高低。在運用 質粒轉染真核細胞表達目的蛋白，或者利用病毒侵染來表達某種目的蛋白時，往往會遇到 蛋白表達量很微量或者不表達的情況，此時采用免疫印跡技術檢測目的蛋白的表達情況很 可能不會出現明顯的信號。在運種情況下，需要判斷到底是目的蛋白真實的表達量很微量， 還是免疫印跡檢測的反應體系出現問題導致沒有出現信號。因此在做免疫印跡檢測時通常 都需要設置陰性對照和陽性對照，在出現上述情況時，若陽性對照工作正常出現明顯的反 應信號，則說明待研究的目的蛋白表達量確定是微量表達或者不表達。
[0004] 常用的標簽有GST標簽、HA標簽、Str巧II標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽 等多種，在蛋白檢測中，不同的目標蛋白根據其性質往往會選擇不同的標簽序列，現有技術 中多W單個標簽作為陽性對照，運樣當待測的多種蛋白質含有多個不同的標簽序列時，貝U 需要多個相對應的陽性對照，即費時費力，也增加了檢測成本。
【發明內容】
[0005] 為了克服現有技術的缺陷，本發明公開了一種多標簽抗原，W滿足大多數免疫印 跡反應設置陽性對照的需求。其技術方案如下：
[0006] 本發明提供了一種多標簽抗原，包括9種標簽，分別為GST標簽、HA標簽、T7標簽、 V5標簽、Myc標簽、Str巧II標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽。
[0007] 優選地，該9種標簽按照GST-HA-T7-V5-Myc-Str巧II-Flag-EGFP-His的順序依次 串聯。
[000引優選地，9種標簽的序列為SEQIDN0. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 本發明還提供了該多標簽抗原的制備方法，包括W下步驟：
[0010](a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分別設置限 審IJ性內切酶位點，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體，測序，得到包含該沈QIDN0. 1序 列的質粒；
[0011] 化）、將步驟（a)中得到的質粒轉化入表達菌株，進行蛋白表達，并使用儀柱純化 該蛋白。
[0012] 優選地，步驟（a)中，設置在5'端的限制性內切酶位點為化OI，設置在3'端的限 制性內切酶位點為化OI。
[0013] 優選地，步驟（a)中，蛋白表達載體為祀T28a。
[0014] 優選地，步驟化）中，表達菌株為大腸桿菌表達菌株Rosseta值E3)。
[0015] 優選地，該多標簽抗原的制備方法包括W下步驟：
[0016](a)、人工合成SEQIDN0:1序列，并在SEQIDN0:1序列的5'端和3'端分別設置限 制性內切酶位點化OI和化OI，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體祀T28a，測序，得 到包含該SEQIDN0:1序列的質粒祀T28a-MultiTag-G9;
[0017]化）、將步驟（a)中得到的質粒祀T28a-MultiTag-G9轉化入大腸桿菌表達菌株 Rosseta(DE3)，進行蛋白表達，并使用儀柱純化該蛋白。
[001引本發明還提供了一種多標簽抗原的重組載體，即根據上述步驟（a)得到的pET28a-MultiTag-G90
[0019] 本發明還提供了上述多標簽抗原在免疫印跡中的應用。
[0020] 本發明公開的多標簽抗原，能夠滿足大多數免疫印跡反應設置陽性對照的需求。 其具有良好的兼容性和很強的免疫印跡反應特異性，并大大節省了檢測成本。
[0021] W下將結合附圖對本發明作進一步說明。
【附圖說明】
[0022] 圖1示出了本發明一個較佳實施例中制備的多標簽抗原的免疫印記（Western blot)實驗結果。
【具體實施方式】
[0023]W下通過具體的實施例對本發明的技術方案做進一步的描述。W下的實施例是對 本發明的進一步說明，而不是限制本發明的范圍。
[0024] 1、MultiTag-Gg人工基因合成
[00巧]MultiTag-Gg包含 9 種常用檢測標簽，分別是GST、HA、T7、V5、Myc、StrepII、Flag、EGFP和His標簽。具體的DNA序列分別是：
[0026]GST標簽
[0027]
[0043]His標簽
[0044]catcatcatcatcatcat 18
[0045] 將上述9種標簽DNA序列依次串聯在一起通過人工基因合成的方法構建出 MultiTag-Gg完整序列，并在此DNA序列5'端加上化OI限制性內切酶位點CCATGG，3'端 加上化OI限制性內切酶位點CTCGAG，通過化OI和化OI雙酶切、割膠回收、T4連接酶連 接克隆至蛋白表達載體祀T28a。MultiTag-Gg完整編碼區為1566bp，共含有522個氨基酸， 表達蛋白的理論分子量為5991抓a.
[0046] 2、MultiTag-G9蛋白的表達與純化
[0047] 將測序正確的祀T28a-MultiTag-G9質粒轉化入大腸桿菌表達菌株 Rosseta值E3)，挑取單菌落接種至50mlLB液體培養基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯 霉素34ug/ml雙抗性篩選，37 °C，200巧m培養過夜。第二天按照2 :100比例轉接至250ml LB液體培養基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選，共轉接4瓶， 37°C，200rpm培養至菌液0D600檢測數值為0. 8時加入誘導劑異丙基-0 -D硫代半乳糖巧 使其終濃度為0. 1-0. 5mM，誘導培養4h后，4°C700化pm離屯、收集菌體。將此菌體按照每克 加入40ml的比例懸浮于20mMTris.Cl,P冊.0,300mM化Cl,10%Glycerol裂解緩沖液，超 聲前加入終濃度ImM苯甲基橫酷氣，超聲波破碎儀進行菌體破碎。超聲裂解條件為超聲3 秒間隔5秒，30%超聲功率，超聲15min。當菌液變得清亮時離屯、收集上清液，取樣進行聚丙 締酷胺凝膠電泳檢測，并采用儀柱純化MultiTag-Gg蛋白，具體純化操作步驟參照NiNTA Beads6FF說明書進行，獲得純度約95%的MultiTag-Gg蛋白（得到的MultiTag-Gg蛋白 濃度為 350ug/ml)。
[004引3、MultiTag-Gg的免疫印跡應用
[0049] 純化好的MultiTag-Gg進行聚丙締酷胺凝膠電泳，按照每泳道上樣5ng MultiTag-G9蛋白進行聚丙締酷胺凝膠電泳，轉膜，封閉，一抗結合，二抗結合，曝光顯色進 行Westernblot免疫印跡反應。9種相對應的商品化標簽單抗均能與MultiTag-Gg蛋白進 行靈敏而特異性的免疫印跡反應，結果如附圖1所示。
[0050] 本發明獲得的多標簽抗原蛋白可作為免疫印跡反應的陽性對照，具有良好的兼容 性和很強的免疫印跡反應特異性。一種多標簽抗原蛋白即可滿足大多數常用標簽免疫印跡 反應的陽性對照之需，兼容性強；其作為免疫印跡反應的陽性對照靈敏度高，只需低至5ng 蛋白即有明顯的免疫印記（Westernblot)反應信號；免疫印跡反應只有單一目的條帶信 號出現，特異性強。
[0051] W上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可W根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可W得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種多標簽抗原，其特征在于，所述多標簽抗原包括9種標簽，分別為GST標簽、HA 標簽、T7標簽、V5標簽、Myc標簽、Str印II標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽。2. 如權利要求1所述的多標簽抗原，其特征在于，所述9種標簽按照GST-HA-T7-V5-My c-Str印II-Flag-EGFP-His的順序依次串聯。3. 如權利要求2所述的多標簽抗原，其特征在于，所述9種標簽的序列為SEQIDNO. 1所 示的核苷酸序列。4. 如權利要求1所述的多標簽抗原的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下 步驟： (a) 、人工合成SEQIDNO: 1序列，并在所述SEQIDNO: 1序列的5'端和3'端分別設置限 制性內切酶位點，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體，測序，得到包含所述SEQIDNO. 1 序列的質粒； (b) 、將步驟（a)中得到的所述質粒轉化入表達菌株，進行蛋白表達，并使用鎳柱純化 所述蛋白。5. 如權利要求4所述的多標簽抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟（a)中，設置在 所述5'端的限制性內切酶位點為NcoI，設置在所述3'端的限制性內切酶位點為XhoI。6. 如權利要求4所述的多標簽抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟（a)中，所述蛋 白表達載體為pET28a。7. 如權利要求4所述的多標簽抗原的制備方法，其特征在于，所述步驟（b)中，所述表 達菌株為大腸桿菌表達菌株R〇sseta(DE3)。8. 如權利要求1所述的多標簽抗原的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下 步驟： (a) 、人工合成SEQIDNO: 1序列，并在所述SEQIDNO: 1序列的5'端和3'端分別設置限 制性內切酶位點NcoI和XhoI，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達載體pET28a，測序，得 到包含所述SEQIDNO: 1序列的質粒pET28a-MultiTag-G9 ; (b) 、將步驟（a)中得到的所述質粒pET28a-MultiTag-G9轉化入大腸桿菌表達菌株 Rosseta(DE3)，進行蛋白表達，并使用鎳柱純化所述蛋白。9. 一種多標簽抗原的重組載體，其特征在于，所述重組載體為根據權利要求8所述的 步驟（a)得到的pET28a-MultiTag-G9。10. -種根據權利要求1或2所述的多標簽抗原在免疫印跡中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種多標簽抗原，該多標簽抗原包括9種標簽，分別為GST標簽、HA標簽、T7標簽、V5標簽、Myc標簽、StrepII標簽、Flag標簽、EGFP標簽和His標簽，這9種標簽按照GST-HA-T7-V5-Myc-StrepII-Flag-EGFP-His的順序依次串聯。本發明還公開了該多標簽抗原的制備方法及其在免疫印跡中的應用。本發明中公開的多標簽抗原，可以滿足大多數免疫印跡反應設置陽性對照的需求，具有良好的兼容性和很強的免疫印跡反應特異性。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/70, G01N33/68, C12R1/19
【公開號】CN105296478
【申請號】CN201510821610
【發明人】曹平生
【申請人】翌圣生物科技（上海）有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月23日