一株二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安 全免疫學檢測領域。
【背景技術】
[0002] 2, 6-二叔下基對甲酪（BHT)，是一種油溶性的有機化合物。它主要在食品添加劑 中被用作為抗氧化劑（E編碼為E321)，也在化妝品、藥物、飛機燃料、橡膠、石油制品和標本 中有抗氧化作用。雖毒性較大，但其抗氧化能力較強，耐熱及穩定性好，既沒有特異臭，也 沒有遇金屬離子呈色反應等缺點，而且價格低廉，僅為抗氧化劑下基徑基茵香酸（BHA)的 1/5~1/8,我國仍作為主要抗氧化劑使用。一般與BHA配合使用，并W巧樣酸或其他有機 酸為增效劑。我國規定可用于食用油脂、油炸食品、餅干、方便面、速煮米、果仁罐頭、干魚制 品和騰臘肉制品，最大使用量0. 2g/kg。
[0003] 目前檢測二叔下基對甲酪的方法主要有氣相色譜法（GC)、液相色譜法（HPLC)、分 光光度法、電化學測定法、氣質聯用法等方法，但是運些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較 貴等缺點，不能實現大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的二叔下基對甲酪檢測 方法具有重要意義。酶聯免疫法（ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時 對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現場快速檢測。然而得到高特異 性和高靈敏度的單克隆單體是免疫學檢測的前提，人工抗原的合成是其中重要的一步。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一株對二叔下基對甲酪具有較好特異性和檢測靈敏度的單 克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用。
[0005] 本發明的技術方案，提供一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細 胞株制備的抗體對二叔下基對甲酪具有較好特異性和檢測靈敏度，可W用來建立二叔下基 對甲酪的免疫學檢測方法。
[0006] 一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細胞株，其命名為2B2,已保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期為2015年5 月19日，保藏編號為CGMCCNo. 10870。
[0007] 二叔下基對甲酪單克隆抗體，由所述保藏號為CGMCCNo. 10870的二叔下基對甲 酪單克隆抗體雜交瘤細胞株2B2所分泌產生。 陽00引本發明提供的2B2細胞株的制備基本步驟為： (1)完全抗原的合成：稱取BHT類似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA)24. 8mg，碳 二亞胺（EDC) 38. 3mg，徑基班巧酷亞胺（畑S) 23.Omg，用1血無水DMF溶解(稱為A液)， 室溫攬拌反應地。稱取牛血清白蛋白（BSA) 56mg溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中 (稱為B液)。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應過夜，得到偶聯物BHTA-BSA 混合液即為完全抗原，通過透析分離完全抗原和未偶聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收 掃描方法鑒定； (2) 小鼠的免疫：選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。二叔下基對甲酪完 全抗原BHTA-BSA與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次 免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之 間間隔21天。最后一次用二叔下基對甲酪完全抗原(不含佐劑)沖擊免疫；通過間接化ISA 檢測血清效價和抑制； (3) 細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤 細胞融合，通過HAT培養基培養，利用間接化ISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭 ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行= 次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株2B2 ; (4) 雜交瘤細胞株性質的鑒定：通過化ISA法測定靈敏度和特異性。
[0009] 所述二叔下基對甲酪單克隆抗體的應用，用于食品安全中對二叔下基對甲酪的殘 留檢測。 陽010] 本發明的有益效果：本發明獲得的抗二叔下基對甲酪單克隆抗體細胞株，對二叔 下基對甲酪有較好的檢測靈敏度和特異性（ICw值為8. 9yg/L)。
[0011] 生物材料樣品保藏：一株二叔下基對甲酪單克隆抗體雜交瘤細胞株，其命名為 2B2,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為：北京 市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，分類命名為單克隆細胞株，保藏 日期為2015年5月19日，保藏編號為CGMCCNo. 10870。
【附圖說明】
[0012] 圖1 2B2單克隆抗體的抑制標準曲線。
【具體實施方式】
[0013] 本發明下面的實施例僅作為本
【發明內容】
的進一步說明，不能作為本發明的限定內 容或范圍。下面通過實施例對本發明作進一步說明。
[0014] 本發明通過將二叔下基對甲酪完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養 基培養，通過間接化ISA和間接競爭化ISA篩選細胞上清，最終得到了對二叔下基對甲酪有 較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0015] 實施例1雜交瘤細胞株2B2的制備 (1)完全抗原的合成：稱取BHT類似物2, 6-二叔下基-4-甲基苯甲酸（BHTA) 24. 8mg，EDC38. 3mg，N服23.Omg，用1血無水DMF溶解(稱為A液)，室溫攬拌反應地。稱取BSA56mg 溶于10血抑7. 4的0.Olmol/LPBS中（稱為B液)。在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中， 室溫反應過夜，得到偶聯物BHTA-BSA混合液即為完全抗原，通過透析分離完全抗原和未偶 聯的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定。
[0016] (2)動物免疫：選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取二叔下基對甲 酪完全抗原BHTA-BSA與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第 一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強 免之間間隔21天。S免后7天采血，使用間接競爭化ISA方法測定小鼠血清效價和抑制， 選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。
[0017] (3)細胞融合：在沖擊免疫S天后，按照常規陽G(聚乙二醇，分子量為4000)方法 進行細胞融合，具體步驟如下： a、 無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網得到脾細胞懸液，并進行細胞計數； b、 收集SP2/0細胞，懸浮于RPMI-1640基礎培養液中，進行細胞計數； C、將脾細胞和SP2/0細胞按照1 : 5的計數比例混合，離屯、后用50%PEG融合，時間1min,之后按照從慢到快，加入RPMI-1640基礎培養液，離屯、后懸浮于含20%胎牛血清、2%的 50XHAT的RPMI-1640篩選培養液中，加到96孔細胞培養板，置于37°C、5% (?的培養箱中 培養。
[0018] (4)細胞篩選與細胞株建立：在細胞融合的第3天對融合細胞進行RPMI-1640篩 選培養液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清、1%的IOOXHT的RPMI-1640過渡培養液 進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接化ISA篩選出陽 性細胞孔，第二步選用二叔下基對甲酪為標準品，用間接競爭化ISA對陽性細胞進行抑制 效果測定。選擇對二叔下基對甲酪標準品均有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞 克隆，用同樣的方法進行檢測。重復=次，獲得細胞株2B2。
[0019] (5)單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟 油ImL;7天后每只小鼠腹腔注射1XIO6雜交瘤細胞，從第屯天開始收集腹水，將腹水通過 辛酸-硫酸錠法純化，獲得的單抗置于-20°C保存。
[0020] 使用間接競爭ELISA，測定單克隆抗體二叔下基對甲酪的ICso為：8. 9yg/L，說明 對二叔下基對甲酪有很好的靈敏度，可用于二叔下基對甲酪免疫分析檢測。 陽02U 實施例2抗體應用 將雜交瘤細胞株2B2通過體內腹水制備的單克隆抗體應用于二叔下基對甲酪的快速 檢測，具體步驟如下： 曰、包被：將包被原BHTA-OVA用0. 05MpH9.6碳酸鹽緩沖液從2嗦/mL開始倍比稀釋， 10〇4 17孔，37°(：反應化； b、洗涂：將板內溶液傾去，甩干，并用洗涂液洗涂3次，每次3min; C、封閉：拍干后，加入200yL/孔封閉液，37°C反應化，洗涂后烘干備用；t加樣：將抗血清從1:1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，IOOyL/ 孔，37°C反應Ih;充分洗涂后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG, 100yL/孔，37°C反應 比； e、 顯色：將酶標板取出，充分洗涂后，每孔加入IOOiiL的TMB顯色液，37°C避光反應 ISmin; f、 終止和測定：每孔加入50M1 2MH2SO4終止液W終止反應，然后用酶標儀測定各孔 的〇〇4日。值； 邑、結果判讀：W〇〇45。值大于或等于陰性對照孔的2. 1倍（即P/N> 2. 1)所對應的血清 最高稀釋倍數即為血清的化ISA效價； 11、標準曲線：配置0、1、2、5、10、20、50和100^旨/16冊標準溶液，采用間接競爭化15八 繪制標準曲線，其ICs。為8. 9yg/L。 陽0巧溶液的配置： 碳酸鹽緩沖液（CBS):稱取NazCOs1.59g，NaHC〇3 2.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合， 加雙蒸水至約SOOmL混勻，調pH值至9. 6,加雙蒸水定容至1000 mL, 4°C膽存備用； 憐酸鹽緩沖液（PBS):8.00g化Cl，0.2gKCl，0.2gKH2P04,2.9gNa2HP04?12H20， 溶于800血純水中，用化OH或肥1調抑到7. 2~7. 4,定容至1000血； PBST:含 0. 05% 吐溫 20 的PBS; TMB顯色液：A液：胞2冊〇4 ? 12&0 18. 43g，巧樣酸9. 33g，純水定容至1000血；B液： 60mgTMB溶于100血乙二醇中；A、B液按體積比1:5混合即為TMB顯色液，現用現混。
[0023] 2B2單克隆抗體的交叉反應率如表1所示。
[0024] 表1. 2B2單克隆抗體的交叉反應率
綜上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并非用來限定本發明的實施范圍。即凡依本 發明申請范圍的內容所作的等效變化與修飾，都應為本發明的技術范疇。
【主權項】
1. 一株二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細胞株，其命名為2B2,已保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo. 10870。2. 二叔丁基對甲酚單克隆抗體，其特征在于：由所述保藏號為CGMCCNo. 10870的二 叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細胞株2B2所分泌產生。3. 權利要求2所述的二叔丁基對甲酚單克隆抗體的應用，其特征在于：用于食品安全 中對二叔丁基對甲酚的殘留檢測。
【專利摘要】一株二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫學檢測領域。本發明的二叔丁基對甲酚單克隆抗體雜交瘤細胞株2B2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.10870。二叔丁基對甲酚單克隆抗體，由所述保藏編號為CGMCC？No.10870的雜交瘤細胞株2B2所分泌產生，此細胞株分泌的單克隆抗體，對二叔丁基對甲酚具有較好的特異性和檢測靈敏度IC50值為8.9μg/L，可以用于食品安全中二叔丁基對甲酚的殘留檢測。CGMCC No.1087020150919
【IPC分類】C07K16/44, C12R1/91, C12N5/20, G01N33/577
【公開號】CN105296436
【申請號】CN201510798015
【發明人】劉麗強, 孫成, 胥傳來, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明
【申請人】江南大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月19日