一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法

一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及農業技術領域，更具體地，涉及一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及 其方法。
【背景技術】
[0002] 糯米糍是主產于廣東廣州、東莞和深圳等地的優良荔枝品種，果實鮮紅色，較 大，單果重26. 5±3. 3g，果肉半透明，軟滑多汁，味濃甜微帶香氣，種子多退化，可食率達 78. . 9±2. 9%，可溶性固形物18~21%，深受國內外消費者喜愛。然而，相對其他荔枝品種來 說，坐果低而且不穩是糯米糍生產上的一個突出問題，嚴重影響了該品種的產量和經濟效 率。一般荔枝的坐果率達不到雌花數量的5%，而糯米糍的更低。最主要的原因是糯米糍果 實在發育的早期胚乳敗育使得坐果不良。荔枝種子屬于無胚乳種子，在種子發育前期種腔 充滿液態胚乳隨著胚的發育胚乳逐漸被胚吸收消耗，胚乳富含各種激素使種子成為代謝中 心，吸引養份供本身和果實的其他部分生長發育之用，所以胚乳的發育直接影響到胚的發 育進程。
[0003] 與其它胚乳早期發育良好的半敗育品種如桂味、妃子笑和綠荷包等相比，糯米糍 的早期坐果率明顯低，提高糯米糍的早期坐果率是提高糯米糍產量的重要措施。在生產上 一般采用提高樹體營養如增施有機肥、噴施保果藥劑2,4-D以及減少營養競爭如斷根和環 割等措施來提高坐果率，農藝保果往往是提高坐果率的有效手段，然而，針對不同樹勢使用 時期較難把握，而2, 4-D常有藥害和提高裂果率的問題。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種提高糯米 糍荔枝坐果率的菌液及其方法。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的： 一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，其特征在于，所述菌液為含有沉默表達載體的ZcC/7基因片段轉化獲得的農桿菌工程菌。
[0006] 本發明通過病毒介導的基因沉默表達技術，將ZcC/7基因和病毒載體結合令 ZcC/7基因沉默表達，從而促進荔枝液態胚乳早期發育，提高荔枝得坐果率。
[0007] 優選地，所述ZcC/7基因片段的序列如SEQIDN0:1所示。
[0008] 優選地，所述沉默表達載體為pTRVl和pTRV2。
[0009] 本發明還提供一種提高糯米糍荔枝坐果率的方法，是利用所述菌液浸染荔枝植 株。
[0010] 優選地，所述荔枝植株為盛花期的植株或花后3周前結有幼果的植株。
[0011] 優選地，所述菌液的〇D6。。為0· 5~1. 5〇
[0012] 優選地，所示浸染方法為噴灑、浸沒。
[0013] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果： 本發明提供了一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，所述菌液為含有沉默表達載體的ZcC/7基因片段轉化獲得的農桿菌工程菌，利用所述菌液浸染植株，可促進促進液態胚乳早 期發育，從而提高糯米糍荔枝的坐果率的技術。該方法適合工廠化生產調控劑，成本低，屬 于短期基因表達干擾技術，無殘留，不影響中后期果實生長發育，有較大的生產應用前景。
【附圖說明】
[0014] 圖1為TRV1 (a)和TRV2 (b)結構示意圖；其中，RdRP為RNA依賴的RNA聚合酶； 16K為富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp為運動蛋白；Cp為衣殼蛋白；MCS為多克隆位點。 圖2為實施例2處理組和對照組種子的形態結構。
[0015] 圖3為對比例1菌液處理后結果。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本 發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單 修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術 人員所熟知的常規手段。
[0017] 實施例1浸染液制備 一、ZcC/7基因片段的克隆 以荔枝kC/沖勺500bp左右片段(序列如SEQIDN0:1)設計引物，并在引物前加上與PTRV2的及mHI和酶切位點同源的15 bp的載體序列接頭，引物序列見下表1，PCR擴 增條件為94°C，2min;98°C，10s，55°C，30s，72°C，30s，30 個循環；72°C，lOmin。取2μ1 進 行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并純化回收。
[0018] 二、病毒沉默載體pTRV2 (pYL156)的酶切 病毒沉默載體pTRVl(pYL192)，pTRV2 (pYL156)結構示意圖如圖1，選取pTRV2 (PYL156)上的及mHI和兩個酶切位點對載體進行雙酶切，限制性內切酶選用NEB(New EnglandBiolabs)公司的ifeazMHF和內切酶。反應體系為：pTRV2質粒1μg，內切 酶各 1yl，l〇XCutsmartBuffer5μL，用水補足至 50μL。于 37°C酶切 15 分鐘，65°C 酶失活20分鐘。酶切產物經酚氯仿抽提后，經2倍的無水乙醇和1/10體積的NaAc沉淀， 用75%的乙醇認真的洗兩次后，將乙醇吹干。把酶切后的線性化質粒溶于20μ1的雙蒸水 中備用。
[0019] 三、重組質粒的提取、連接、轉化以及鑒定 利用GibsonAssembly?MasterMix(NewEnglandBiolabs)對步驟一純化后的PCR擴增產物和步驟二得到的線性化載體進行連接，具體反應體系為：1μ1純化回收的PCR 擴增產物，1μL線性化載體，4μL2XGibsonAssemblyMasterMix，用水補足8μ1〇 50°C反應半小時后取2μι轉入50μι大腸桿菌DH5a感受態，測序鑒定結果正確的即為pTRV2-LcCIF重組質粒，擴搖提取質粒。
[0020] 四、利用凍融法將重組質粒轉化農桿菌 取出100μ1GV3101農桿菌感受態細胞于冰上解凍，立即加入5μ1重組質粒DNA。 輕彈，冰上放置30min，液氮中冷凍5min，37°C水浴中溫浴5min，冰上2min，加入無抗生 素的 500μL的YEP(AgrobacteriumGrowthMedium)液體培養基，28°C搖 3 ~4h。3000 r，離心3min，去培養基500μL，剩下的100μL全部均勻涂布于YEP固體培養基上（100 yllOOmgI1Kan, 50μL50mgllif)。28°C靜止 2 ~3d。搖菌于含抗生素的（100 μL100mgl1Kan, 50μL50mgpRifOYEP培養基中，28°C，250rpm振蕩過夜，菌液 PCR驗證。
[0021] 五、質粒的大規模提取 挑取陽性克隆于500μ1含有100μgml1Amp的LB(Lysogenybroth，LB)液體培 養基中，過夜培養。轉接100μ1菌液至10mlLB液體培養基37°C過夜培養，15，000g 離心1min收集菌體，按照每毫升菌體加： SolutionI100μ1 (冰浴 5min劇烈振蕩） SolutionII200μ1 (冰浴 5min輕輕混勾） SolutionIII150μ1 (冰浴 5min輕輕混勾） Solution(I~III)參見分子克隆實驗指南(莎姆布魯克，美，2005)。
[0022] 15，000g離心5min，上清加入RNAse(10mgml3 37°C1h后加入等體積酸： 氯仿（1:1)，劇烈振蕩后15，000g5min離心，取上清，加入等體積氯仿異戊醇，15，000 g，5min上清加1/10體積2. 5MNaAc和2體積無水乙醇，-20°C沉淀10min后，用75%乙 醇洗滌，晾干后加入適量適量雙蒸水溶解。
[0023] 六、農桿菌的擴大培養以及侵染 每 100mlYEP培養基中加入 100μ1 100mgI1Kan, 50μ1 50mgI1Rif。挑取 單菌落至2ml離心管含有500μ1YEP培養基，后轉入50ml離心管搖菌15ml，28°C， 200r.m，搖菌過夜。包括pTRVl和pTRV2-LcCIF兩種菌。
[0024] 將第一天搖好的菌液，按1 :50或1 :25稀釋到新鮮的YEP培養基中，每100mlYEP 培養基加入1ml1MMES(終濃度10mM)，10μ1乙酰丁香酮母液(終濃度20mM)，100μ1 100mg1 1Kan, 50μL50mg1 1Rif。500ml三角瓶搖菌 100-200ml，28°C，200rpm 搖菌過夜。
[0025] 3000g離心15min，倒掉培養基，用槍吹吸菌體使之均勻懸浮在侵染液中，吸 打混勻直至無塊狀。用分光光度計測重懸菌液濃度，使〇D6。。在1. 0~3. 0,將pTRVl和 pTRV2-LcCIF菌液按體積1 :1混合，暗處靜置4~6小時。
[0026] 實施例2荔枝的農桿菌侵染處理 選取三株雌花盛開期的"糯米糍"作為實驗材料，于3月19日（雌花盛花期）利用實施 例1制備得到的〇D_=l. 0浸染液進行噴花處理(處理組)，對照組為同樣0D_的pTRVl和 PTRV2混合菌液進行噴花處理。處理后50天(第一和第二次生理落果后）對平均穗坐果率 和種胚發育情況進行調查。
[0027] 結果表明：與對照相比，處理組"糯米糍"荔枝的單果穗的掛果數明顯增加，對照平 均單穗坐果為1. 68±0. 48個，而處理組則為2. 57±0. 45個，平均坐果數比對照提高53%。 花后50天，對照果實和種子平均重分別為1. 67±0. 07g和0. 293±0. 017g，處理組分別為 1. 66±0. 07g和0. 291±0. 016g，兩者無明顯差異，然而，從種子的形態看，處理組種子的內 腔明顯大于對照種子(見圖2)，荔枝果實發育種子種皮的大小決定于液態胚乳量，液態胚乳 量越多，種皮越大，這結果說明處理組果實液態胚乳的發育明顯多于對照果實。
[0028]對比例1 試驗方法同實施例2,唯一不同的是所用的浸染液的0D_=2. 5,噴花處理50天后，結果 表明：隨著侵染液濃度的增加，處理組的掛果數并沒有顯著的增加，并且隨著侵染液濃度的 增加，有提高落果率的風險(見圖3)。
【主權項】
1. 一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，其特征在于，所述菌液為含有沉默表達載體的 ZcC/7基因片段轉化獲得的農桿菌工程菌。2. 根據權利要求1所述的菌液，其特征在于，所述ZcC/7基因片段的序列如SEQ ID NO : 1所示。3. 根據權利要求1所述的菌液，其特征在于，所述沉默表達載體為pTRVl和pTRV2。4. 一種提高糯米糍荔枝坐果率的方法，其特征在于，是利用權利要求1所述菌液浸染 蒸枝植株。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述荔枝植株為盛花期的植株或花后3周 前結有幼果的植株。6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌液的0D 6。。為0. 5~1. 5。7. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所示浸染方法為噴灑、浸沒。
【專利摘要】本發明涉及農業技術領域，具體公開了一種提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法，所述菌液為含有沉默表達載體的<i>Lc</i><i>CIF</i>基因片段轉化獲得的農桿菌工程菌，利用所述菌液浸染植株，可促進液態胚乳早期發育，從而提高糯米糍荔枝的坐果率的技術。該方法適合工廠化生產調控劑，成本低，屬于短期基因表達干擾技術，無殘留，不影響中后期果實生長發育，有較大的生產應用前景。
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/08, A01G7/06
【公開號】CN105274136
【申請號】CN201510652694
【發明人】王惠聰, 張潔瓊, 吳子辰, 劉戀, 趙杰堂, 黃旭明
【申請人】華南農業大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2015年10月10日