超薄膜構筑的塊體大孔復合材料固定化漆酶的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于固定化酶制備技術領域，具體涉及一種由CS/Si02超薄膜構筑的塊體大孔復合材料固定化漆酶的制備方法。
【背景技術】
[0002]漆酶是一種含銅多酚氧化酶，廣泛存在于多種生物體內。漆酶具有寬泛的底物專一性和較好的穩定性，能催化氧化多種難降解有機污染物，包括酚類化合物、多環芳烴、多氯聯苯及其衍生物、除草劑、殺蟲劑等，它在廢水處理、生物傳感器構建、生物制漿、食品加工以及有機合成等方面有重要應用價值。因此，國內外科學家在生物、化學、物理、醫學等多領域對漆酶開展了廣泛的研究工作。
[0003]游離的漆酶因在使用過程中易隨環境的變化變性失活、易混入產品和不易循環利用等使其應用受到限制。對漆酶進行固定化是實現其重復利用、改善其穩定性的有效方法。固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學的方法固定在有機或無機載體上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反應中，它以固相狀態作用于底物，反應完成后，容易與水溶性反應物分離，可反復使用。固定化酶不但仍具有酶的高度專一性和高催化效率的特點，且比水溶性酶穩定，可較長期使用，具有較高的經濟效益。
[0004]漆酶固定化的方法主要有物理方法和化學方法兩種。物理方法主要有吸附法、包埋法和離子交換法，化學方法主要有共價結合法和交聯結合法。近年來國際上對漆酶的固定化進行了較為廣泛的研究，使用的載體包括殼聚糖、親水性微濾膜、Si02納米顆粒、介孔5102和介孔碳等多種材料。但是現有的固定化漆酶普遍存在著生產成本高、制備工藝復雜、分離效果差、重復使用率低等缺點。
[0005]復合材料是由兩種或兩種以上不同性質的材料通過物理或化學的方法，在宏觀上組成具有新性能的材料。各種材料在性能上互相取長補短，產生協同效應，使復合材料的綜合性能優于原組成材料而滿足各種不同的要求。殼聚糖的分子結構中含有大量自由的氨基和羥基，因此殼聚糖具有聚陽離子、螯合、易成膜、pH敏感、濕度敏感等性質和較高的化學活潑性，其分子中大量的氨基和羥基能與大孔二氧化硅材料中的羥基形成氫鍵，可以很好地吸附在Si02大孔材料孔壁表面成膜，形成有機-無機大孔復合材料。將該材料用于固定化漆酶，可體現其優異的性能。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種以CS/Si02超薄膜構筑的塊體大孔復合材料為載體的固定化漆酶及其制備方法。
[0007]本發明所提供的固定化漆酶的制備方法是，以我們前期制備的塊體(長、寬、高為
0.2 ?0.4cm) Si02 大孑L材料(Ruifeng Zhang, Nengbing Long, Lele Zhang, Thin SolidFilms, 517 (2009), 6677-6680)為原料；利用該大孔材料具有穩定的骨架結構、孔徑大、傳質效率高、孔道表面含有豐富的羥基等諸多特點，采用物理吸附法將殼聚糖吸附在Si02大孔材料孔壁表面，再用雙功能交聯劑交聯殼聚糖大分子，形成一種由CS/Si02超薄膜構筑的塊體大孔復合材料。以所制備的大孔復合材料為載體，將漆酶通過物理吸附作用固定在該載體上。具體制備方法如下:
[0008](1)載體的制備:稱取一定質量的殼聚糖溶于質量分數為1?3%的乙酸溶液中，配制成質量分數為0.5?5%的殼聚糖溶液；稱取所需干燥的塊體Si02大孔材料浸入殼聚糖溶液中，在室溫下振蕩1?12h，濾出大孔材料、真空干燥；先用堿溶液反復沖洗、再用蒸餾水反復沖洗，50?80°C下干燥2h ;將干燥的大孔材料浸入含雙功能交聯劑質量分數為1?3%的溶液中振蕩反應3?12h，濾出大孔材料、用蒸餾水反復沖洗、真空干燥，即得固定化酶所用的載體。
[0009](2)漆酶的固定:將步驟⑴中得到的載體浸入用緩沖溶液配制的漆酶溶液中，在5?30°C下振蕩2?12小時，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。
[0010]步驟(1)中所述的堿溶液為氨水或碳酸鈉水溶液中的一種；所述的雙功能交聯劑為戊二醛、乙二醛、乙二醇二縮水甘油醚或丁二醇二縮水甘油醚中的一種。
[0011]步驟⑵中所述的漆酶溶液的濃度為1?80 mg.ml \ pH值為2?7 ;緩沖溶液可以是醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或兩種。
[0012]本發明與現有技術相比，具有如下優點和有益效果:(1)本發明提供的固定化漆酶，制備工藝簡單，成本低廉；(2)本發明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高，可以達到90%以上；(3)本發明使用塊體大孔復合材料固定化漆酶，易從反應體系中分離出來、便于重復使用、應用于實際生產中。
【具體實施方式】
[0013]下面的實施例是對本發明的進一步說明，本發明的范圍不受實施例的限制。
[0014]實施例1:
[0015](1)稱取0.4g殼聚糖，加入質量分數為2%的乙酸溶液中，配制成質量分數為1%的殼聚糖溶液；
[0016](2)稱取2g塊狀Si02大孔材料于80°C下干燥2h，置于含1 %殼聚糖溶液的磨口錐形瓶中，在25°C、轉速為50 r -min 1的搖床中振蕩6小時、濾出大孔材料、在50°C下干燥2h，先用0.1M的碳酸鈉溶液反復沖洗、再用蒸餾水反復沖洗，60°C下干燥2h ；
[0017](3)將上述干燥后的大孔材料浸入含乙二醇二縮水甘油醚質量分數為3 %的溶液中振蕩反應6h，濾出大孔材料、用蒸餾水反復沖洗、真空干燥，即得固定化酶用的載體；
[0018](4)稱取lg載體，浸入10 ml用pH = 4.5緩沖溶液配置的濃度為20 mg *ml 1的粗漆酶溶液中，在30°C、轉速為50 r -min 1的搖床中振蕩2小時、濾出塊體材料，用緩沖液洗滌至上清液中檢測不到蛋白，即得固定化漆酶。其酶活為66.5U *g 1 (定義一分鐘使1 μ mol的ABTS氧化所需的酶量為一個酶活單位U)。
[0019]實施例2:
[0020](1)稱取0.8g的殼聚糖，加入質量分數為2%的乙酸溶液中，配成質量分數為2%的殼聚糖溶液；
[0021](2)稱取2g塊狀Si02大孔材料于80°C下干燥2h，置于含2%殼聚糖溶液的磨口錐形瓶中，在30°C、轉速為50 r.min 1的搖床中振蕩10小時、濾出大孔材料、在50°C下干燥3h，先用0.1M的碳酸鈉溶液反復沖洗、再用蒸餾水反復沖洗，60°C下干燥2h ；
[0022](3)將上述60°C下干燥后的大孔材料浸入含戊二醛質量分數為1%的溶液中振蕩反應12h，濾出大孔材料、用乙醇和蒸餾水反復沖洗、真空干燥，即得固定化酶用的載體；
[0023](4)稱取2g載體，浸入20 ml用pH = 4.5緩沖溶液配置的濃度為40 mg.ml 1的粗漆酶溶液中，在30°C、轉速為50 r.min 1的搖床中振蕩4小時后用8?10目的篩網濾出，用緩沖液洗滌至上清液中檢測不到蛋白，即得固定化漆酶。其酶活為136.8U.g、
【主權項】
1.一種由05/5102超薄膜構筑的塊體大孔復合材料固定化漆酶，其特征在于，該固定化漆酶呈大尺寸的塊狀，易從反應體系中分離，便于重復使用；孔徑大，孔道完全開放，傳質效率高。2.—種由CS/Si02超薄膜構筑的塊體大孔復合材料固定化漆酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:用緩沖溶液配制一定濃度的漆酶溶液；將由CS/Si02超薄膜構筑的塊體大孔復合材料浸入漆酶溶液中，在5?30°C下振蕩2?12小時，濾出、用緩沖液洗滌至溶液中檢測不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述的緩沖溶液可以是醋酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽中的一種或兩種，所述的漆酶溶液的濃度為1?80 mg *ml \ρΗ值為2?7。
【專利摘要】本發明涉及一種塊體大孔復合材料固定化漆酶的制備方法，屬于固定化酶制備技術領域。該固定化漆酶是以由二氧化硅/殼聚糖超薄膜構筑的塊體大孔復合材料為載體，將漆酶通過物理吸附法固定在載體上。其制備方法包括載體的制備和漆酶的固定兩個步驟。載體的制備：將殼聚糖吸附在SiO2大孔材料孔壁表面，再用雙功能交聯劑交聯殼聚糖大分子，制備出由二氧化硅/殼聚糖超薄膜構筑的載體成品；漆酶的固定：將載體浸入漆酶溶液，在室溫下振蕩反應，經洗滌、干燥，得固定化漆酶成品。本發明提供了一種新型固定化漆酶及其制備方法，具有制備工藝簡單，成本低廉，固定化漆酶活力高、性質穩定等特點。
【IPC分類】C12N11/14, C12N11/10
【公開號】CN105274085
【申請號】CN201410341927
【發明人】鄭璐夢, 梁云霄, 劉曉貞, 張瑞豐, 李云, 江思
【申請人】寧波大學
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月11日