一種脆弱擬桿菌的液固結合發酵工藝的制作方法
【專利說明】一種脆弱擬桿菌的液固結合發酵工藝
[0001]
技術領域
[0002]本發明涉及微生物領域，尤其涉及一種為脆弱擬桿菌為主微生態的液固結合發酵工藝。
【背景技術】
[0003]脆弱類桿菌(b.fragilis)能分解糖，對膽汁耐受，為類桿菌屬的代表株。革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓而濃染，中間有不著色部份。專性厭氧、無芽胞、無動力、直徑為0.5X1.3?1.6um。脆弱類桿菌為專性厭氧菌，氯化血紅素和20%膽汁可促進其生長，生化反應弱，解糖。解酶反應陽性，葡萄糖的終末代謝產物有乙酸和琥珀酸；吲哚不定，耐膽鹽，水解七葉靈。不還原硝酸鹽。產生蘋果酸鹽脫氫酶、谷氨酸脫氫酶、葡萄糖6磷酸脫氫酶(g6pdh)、6磷酸葡萄糖脫氫酶(6pgdh)、細胞壁粘肽層含有二氨基庚二酸。依據對鼠李糖、海澡糖，甘露醇發酵及吲哚試驗可區別本組菌落。dna的g c含量為39?48%。本菌主要分布于結腸和口腔中。脆弱類桿菌致病因素有內毒素，由脂多糖和類脂a構成。脂多糖決定其抗原性，類脂a決定其毒性。由于它的內毒素的化學結構與典型內毒素不同，所以毒性比一般內毒素為低，但發現它的內毒素在體外能抑制中性白細胞的趨化性和吞噬作用。脆弱類桿菌還能產生β_內酰胺酶，破壞青霉素，故對青霉素有耐藥性。本菌還產生肝素酶，這種酶有利于形成血栓性靜脈炎和遷徙性膿腫。脆弱類桿菌還分泌透明質酸酶，dna酶，神經氨酸酶等，均與其侵襲力有關。脆弱擬桿菌e抗原與其致病性有關，如化膿，白血球先降低后升高，肝、肺，腎組織病變等。在臨床上的無芽胞厭氧菌感染中占有重要的地位。
[0004]現有的培養技術主要是利用牛心腦浸液血瓊脂、硫乙醇酸鈉培養基、胰酶大豆瓊脂和卡那霉素一萬古霉素血瓊脂。標本接種后置于37°C厭氧環境培養(如厭氧手套箱或厭氧罐)2 — 3d，挑選生長的菌落接種兩個血平板，分別置于有氧和無氧環境中培養48h。但是現在一般都是菌株接種于液體培養基中，然后在無氧恒溫狀態下經12-72小時發酵，然后再進行過濾、洗滌、稀釋、測菌，這樣得出的菌株較少，而且操作復雜，浪費人力物力。
【發明內容】
[0005]根據以上技術問題，本發明提出一種脆弱擬桿菌的液固結合發酵工藝，其特征在于一種脆弱擬桿菌的液固結合發酵工藝為:
(1)制取液體培養液
首先制取液體培養液，其重量百分比為蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHP040.1-0.3%、硫乙醇酸鈉 0.02-0.1%、牛肝浸液 30-60%、牛肉浸液30-60%、酵母膏0.1-0.8% ；
(2)—級菌種培養
以上述培養液作為培養基，裝入細口試驗瓶，121°C滅菌40分鐘，然后接種5%原種培養物，在培養基上覆蓋0.5mm的無菌食用植物油，然后以磨口瓶蓋分封口，最后將培養器皿置于38 °C真空培養箱培養48小時；
(3)二級菌種培養
培養基及操作同以及菌種培養，但培養皿換為無色透明試劑瓶，接種一級菌種10%后，每隔5小時晃動1分鐘，培養48小時，當細胞達到1.0億CFU\g時終止培養，室溫下保存備用；
(4)固體培養
制備固體培養基，豆柏粉1000g，浸潤后進行蒸煮滅菌，將步驟3中的二級菌種培養液和固體培養基按照重量比0.1:1混合在一起，然后將培養物放入真空無菌室進行培養，恒溫38 °C，發酵48個小時，至細胞數達4-6億。
[0006]本發明的有益效果為:本發明采用液固相結合的發酵工藝，經本工藝可以在短時間內得到大量的脆弱擬桿菌，本發明工藝簡單、投資少，操作時易于控制，在操作時都是在真空無菌條件下進行，不易感染雜菌，菌株濃度高。與單純液體發酵的脆弱擬桿菌相比液固發酵出的脆弱擬桿菌營養成分齊全并具有較強的生物活性，對防治急慢性腸炎、菌群失調、上呼吸道感染和神經功能正等均有很好的療效，用作飼料添加劑可以正價畜、動物體重、產蛋量及增強抗病力，還可以用于制備化妝品、保健食品和飲料等。
[0007]
【具體實施方式】
根據【具體實施方式】對本發明進行進一步說明:
實施例1
(1)首先制取液體培養液，其重量百分比為蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸 0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHP040.1-0.3%、硫乙醇酸鈉 0.02-0.1%、牛肝浸液30-60%、牛肉浸液 30-60%、酵母膏 0.1-0.8% ；
(2)—級菌種培養
以上述培養液作為培養基，裝入細口試驗瓶，121°C滅菌40分鐘，然后接種5%原種培養物，在培養基上覆蓋0.5mm的無菌食用植物油，然后以磨口瓶蓋分封口，最后將培養器皿置于38 °C真空培養箱培養48小時；
(3)二級菌種培養
培養基及操作同以及菌種培養，但培養皿換為無色透明試劑瓶，接種一級菌種10%后，每隔5小時晃動1分鐘，培養48小時，當細胞達到1.0億CFU\g時終止培養，室溫下保存備用；
(4)固體培養
制備固體培養基，豆柏粉1000g，浸潤后進行蒸煮滅菌，將步驟3中的二級菌種培養液和固體培養基按照重量比0.1:1混合在一起，然后將培養物放入真空無菌室進行培養，恒溫38 °C，發酵48個小時，至細胞數達4-6億。
[0008]實施例2
將養雞場同種同日齡的產蛋雞100只，在相同的生活條件下，用同種飼料喂養，隨機抽樣，分成AB兩組各50只，A組每日每只雞服用添加有液固工藝發酵出的菌的飼料，B組每日每只雞服用添加有液態培養工藝發酵出的菌，添加的菌數相同，試驗期為2個月，其中喂食帶有添加劑的飼料一個月，喂食不帶有添加劑的飼料一個月，在兩個月中A組產蛋產量相對于B組增加17.53Kg。
[0009]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進，這些改進也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種脆弱擬桿菌的液固結合發酵工藝為: 首先制取液體培養液，其重量百分比為蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHP040.1-0.3%、硫乙醇酸鈉 0.02-0.1%、牛肝浸液 30-60%、牛肉浸液30-60%、酵母膏0.1-0.8% ； 一級菌種培養 以上述培養液作為培養基，裝入細口試驗瓶，121°C滅菌40分鐘，然后接種5%原種培養物，在培養基上覆蓋0.5mm的無菌食用植物油，然后以磨口瓶蓋分封口，最后將培養器皿置于38 °C真空培養箱培養48小時； 二級菌種培養 培養基及操作同以及菌種培養，但培養器皿換為無色透明試劑瓶，接種一級菌種10%后，每隔5小時晃動1分鐘，培養48小時，當細胞達到1.0億CFU\g時終止培養，室溫下保存備用； (4)固體培養 制備固體培養基，豆柏粉1000g，浸潤后進行蒸煮滅菌，將步驟3中的二級菌種培養液和固體培養基按照重量比0.1:1混合在一起，然后將培養物放入真空無菌室進行培養，恒溫38 °C，發酵48個小時，至細胞數達4-6億。
【專利摘要】本發明提出一種脆弱擬桿菌的液固結合發酵工藝，首先制取液體培養液，其重量百分比為蛋白胨0.5-2.5%、葡萄糖0.2-0.5%、半胱氨酸0.001-0.5%、NaCl0.2-0.5%、NaHPO40.1-0.3%、硫乙醇酸鈉0.02-0.1%、牛肝浸液30-60%、牛肉浸液30-60%、酵母膏0.1-0.8%；本發明采用液固相結合的發酵工藝，經本工藝可以在短時間內得到大量的脆弱擬桿菌，本發明工藝簡單、投資少，操作時易于控制，在操作時都是在真空無菌條件下進行，不易感染雜菌，菌株濃度高。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/01
【公開號】CN105274019
【申請號】CN201410319989
【發明人】王軍, 程亞龍, 翟建武
【申請人】王軍
【公開日】2016年1月27日
【申請日】2014年7月8日