魚鰾膠原抗氧化抗疲勞蛋白肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種從水生生物提取的多膚，尤其設及一種魚饌膠原抗氧化抗疲勞蛋 白膚。
[0002]
【背景技術】
[0003] 自由基是機體許多生化反應的中間產物，正常情況下，其產生和清除處于平衡狀 態。但是，當運一平衡被打破時，自由基會使機體處于氧化壓力之下，通過攻擊生命大分子 物質及各種細胞器，造成機體在分子、細胞及組織器官水平的各種損傷，加速機體的衰老、 疲勞并誘發各種疾病。
[0004] 根據自由基理論，人體疲勞的產生和體內自由基生成相關，因而具有抗氧化活性 的物質存在潛在的抗疲勞活性。
[0005] 天然的生物活性物質相對于市售的合成劑，具有健康安全的優勢，因此，開發海洋 生物活性物質具有重要意義。
[0006] 膠原蛋白主要存在于動物的骨、腫、軟骨和皮膚等結締組織中，是結締組織中膠原 蛋白纖維的蛋白質。膠原蛋白在發展歷史過程中，其重要的材料來源一直是陸生動物豬和 牛，因為它們具有來源豐富的皮和骨。雖然，人們早已了解了魚膠原蛋白，但遺憾的是，未能 將其作為工業上應用的重要材料，運主要是由于水產捕拱來源不穩定，缺乏規模。近年來， 環境等諸多因素引發了陸生動物疾病的產生，如瘋牛病等，陸生動物蛋白質的安全性受到 質疑；而水產養殖和水產品加工業有了很大的發展，魚皮、魚鱗、魚骨和魚內臟等魚類加工 下腳料的來源日趨穩定，且具有安全性。因而，對魚類膠原蛋白的應用與開發已經成為人們 關注的熱點。然而，膠原蛋白獨特的Ξ螺旋結構是非常穩定的，加熱時間短和加熱溫度一般 時都難W使其分解，因而不容易被消化吸收。而膠原蛋白水解而得的膠原蛋白膚卻能彌補 運一缺陷，其分子量小，易于身體吸收。國內外的研究已經表明，水產膠原蛋白膚具有多種 功能，包括抗氧化、抗疲勞、抑制血管緊張素轉化酶、提高免疫力、抗衰老和抗腫瘤等，并且 W其具有的高度生物安全性，可廣泛應用于食品、化妝品及醫藥制備等領域，開發前景非常 廣闊。
[0007] 魚饌作為漁業加工下腳料，常被廢棄或作為簡單的加工材料而得不到充分的利 用。目前，對于魚饌蛋白膚的制備及其活性的相關研究甚少，因此，W養殖大黃魚魚饌為原 料制備多膚并研究其抗氧化與抗疲勞活性，為海洋藥物和保健食品開發提供理論和實驗依 據。
[0008]
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于提供一種魚饌膠原抗氧化抗疲勞蛋白膚，該蛋白膚具有抗氧 化、抗疲勞的特性。
[0010] 本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為：一種魚饌膠原抗氧化抗疲勞 蛋白膚，該魚饌膠原抗氧化抗疲勞蛋白膚的氨基酸序列為G1 y-G 1 U-Pr0-G1 y-PrΟ-Met-G ly-Leu-Ala-Gly-Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pr〇-Asn-His (GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH)，其分子量為6719. 5718Da。該蛋白版具有安全無毒副作用 和抗氧化抗疲勞活性強等優點。
[0011]
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發明的蛋白膚分子量測定質譜圖； 圖2是本發明的蛋白膚高效液相色譜C18柱洗脫峰整體洗脫圖； 圖3是本發明的蛋白膚高效液相色譜C18柱洗脫峰局部洗脫圖。
[0013]
【具體實施方式】
[0014] W下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0015] 實施例：養殖大黃魚魚饌為原料制備多膚并研究其抗氧化與抗疲勞活性，為海洋 藥物和保健食品開發提供理論和實驗依據。魚饌膠原蛋白多功能膚的制備方法，其包括W 下步驟： 1)清洗步驟：選取魚饌用流動水徹底清洗，剪成小塊兒（0. 5X0. 5cm。用0. 1Μ化0H W1:10(w/v)，每4h更換一次溶劑，然后用冷蒸饋水洗至中性，可除去非膠原蛋白等雜蛋 白；為了脫脂，接著用10%正下醇Wl:l〇 (w/v)的比例浸泡12h，每3h更換一次溶劑，然 后用10倍體積的冷蒸饋水沖洗；在浸泡于85%左右的乙醇中12h，每3h更換一次溶劑， 最后用冷蒸饋水沖洗。將預處理好的魚饌進行勻漿，備用。
[0016] 2)酶解步驟：W包含動物、植物及微生物蛋白酶在內的4種商業化蛋白酶(木瓜 酶、膜蛋白酶、胃蛋白酶及堿性蛋白酶)，分別在其最適條件下酶解勻漿后的魚饌，酶解時間 均為6h，加酶量均為魚饌勻漿質量的2%，料液比為1:3 ; 3)純化步驟：上述步驟處理得到的組分濃縮、冷凍干燥后，通過Se地adexG-25層析 柱（2.6cmX60cm)進一步分離純化，樣品濃度為25111旨/1^，上樣量為2血，用去離子水洗脫， 洗脫速度為1. 5mL/min，于紫外分光光度計280nm下檢測，收集各洗脫峰，濃縮后冷凍干燥， 檢測各洗脫組分的抗氧化活并收集活性較高的洗脫峰進行濃縮，冷凍干燥，W0. 1%TFA去 離子水配制Img/mL樣品溶液，過0. 22μm微孔濾膜，利用RP-HPLC進一步分離純化，色譜 分析條件為：進樣量，20yL;色譜柱類型，C18HypersilBDS(250mmX4.6mm，5帕）；柱 溫，30°C;流動相為乙臘-水溶液（含有0. 1血/100血的Ξ氣乙酸），采用梯度洗脫，在 50min洗脫時間內乙臘濃度由0%線性遞增至100% ;洗脫流速，1.OmL/min;紫外檢測波長設 定280nm。同樣收集各洗脫峰后，濃縮并冷凍干燥，經活性篩選出抗氧化活性最強的組分作 為目標膚氨基酸序列為：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His(GEPGPMGLAGPLGPAGGSYESKPNH)〇
[0017] 自由基是機體許多重要的生化反應的中間代謝產物，正常狀況下，其產生和清除 處于動態平衡。然而，自由基是有效的防御系統，如果機體不能維持運一動態平衡，則會 使自己處于氧化壓力狀態下，自由基通過攻擊機體大分子物質和細胞器，對機體造成損傷。 然而，肌肉細胞含有復雜的內源性細胞防御機制W清除氧自由基巧日谷脫甘膚過氧化物酶 (GSH-Px)、超氧化物歧化酶（SOD)、過氧化氨酶（CAT)等)，對機體由運動引發的氧化損傷和 DNA損傷具有一定的保護作用。GSH-Px可加速&〇2和G甜的反應，并將它們轉化為水和氧 化性谷脫甘膚；SOD可W清除超氧陰離子自由基；CAT可W降解徑自由基。
[001引 表1本發明蛋白膚（SBP-III-3)對小鼠負重游泳時間的影響_
注：與對照組比較沖<0. 05, *沖<0. 01 ;與低劑量組比較平<0. 05,bp<0. 01 評價劇烈運動能力的又一重要指標是能量W糖原形式儲存的能力。運動所需能量首先 來源于糖原的分解，然后來自肌肉和肝臟中的糖原流通。運動中，當肌糖原減少時，肝糖原 含量的降低則成為運動耐力的主要限制因素。因此，增加肝糖原和肌糖原儲備有利于增強 耐力和運動能力。各劑量組小鼠的肝糖原水平明顯高于對照組，并且高劑量組顯著高于低 劑量組（P<0. 05或P< 0. 01)。劑量組SBP-HG和SBP-MG小鼠的肌糖原水平明顯高于對照 組（P< 0.01)。此結果表明，純化膚可通過維持體內糖原含量為機體儲備能量而達到抗疲 勞的效果。
[0019] 表2本發明蛋白膚（SBP-III-3)對小鼠抗氧化酶活力的影響
注：與對照組相比*尸< 0. 05，**Κ0. 01 ;與低劑量組相比a尸< 0. 05，V< 0. 01 實驗通過測定SOD、GSH-Px和CAT的活性W評價純化膚SBP-III-3的抗氧化活性。結 果如表2所示與對照組相比，劑量組SBP-HG和SBP-MG小鼠體內的T-S0D活性分別增加了 44. 2%和15. 7%，具有差異顯著性，然而低劑量組SBP-LG則增加了 4. 2%，與對照組并無顯 著性差異（P< 0.05)。另外，劑量組SBP-HG和SBP-MG之間也有顯著差異性（P< 0.01)。 GSH-Px和CAT的活性與T-S0D具有相同趨勢。丙二醒（MDA)是一種脂質過氧化物，可W反 映機體自由基的含量。本實驗還檢測了小鼠肝臟和血漿中的MDA含量。結果如表3所示， Ξ個劑量組小鼠的MDA水平均低于對照組水平，且高、中劑量組小鼠的肝臟中MDA含量均顯 著高于對照組（P< 0.05或P< 0.01)。W上研究結果表明，該純化膚可能通過控制自由 基的積累W保護機體不受氧化損傷，從而具有抗疲勞的效果。
[0020] 表3本發明蛋白膚（SBP-III-3)對小鼠血漿和肝臟中MDA含量的影響
注：與對照組相比*/^ < 0. 05，**Κ0. 01 ;與低劑量組SBP-LG相比節< 0. 05，V< 0. 01 盡管已結合優選的實施例描述了本發明，然其并非用W限定本發明，任何本領域技術 人員，在不脫離本發明的精神和范圍的情況下，能夠對在運里列出的主題實施各種改變、同 等物的置換和修改，因此本發明的保護范圍當視所提出的權利要求限定的范圍為準。
【主權項】
1. 一種魚鰾膠原抗氧化抗疲勞蛋白肽，其特征該魚鰾膠原抗氧化抗疲勞蛋白肽的氨基 酸序列為： Gly-Glu-Pr〇-Gly-Pr〇-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Ala-Gly-Gly-Ser-T yr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His，其分子量為6719. 5718Da〇
【專利摘要】本發明涉及一種魚鰾膠原抗氧化抗疲勞蛋白肽，該魚鰾膠原抗氧化抗疲勞蛋白肽的氨基酸序列為：Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Gly-Gly-Ser-Tyr-Glu-Ser-Lys-Pro-Asn-His，其分子量為6719.5718Da。該蛋白肽具有安全無毒副作用和抗氧化抗疲勞活性強等優點。
【IPC分類】A61P39/00, A61K38/17, A61P39/06, C07K14/46
【公開號】CN105254737
【申請號】CN201510758952
【發明人】丁國芳, 曾麗, 徐銀峰, 賈盈露, 余方苗, 陳銳
【申請人】浙江海洋學院
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月10日