一種抗菌肽fk及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學技術領域，具體設及一種菌膚FK及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著傳統抗生素的大規模和不恰當使用，微生物對傳統抗生素產生了越 來越強的耐藥性。目前應對微生物耐藥的唯一手段是使用新型或者替代性的抗生素藥物， 運就需要持續開發新型抗微生物劑。抗菌膚是一種生物體內合成的天然小分子多膚，是多 細胞生物天然免疫系統的重要功能分子，對細菌、真菌、病毒和原蟲等均具有直接殺滅作 用。抗菌膚具有分子量小、結構簡單、殺菌活性強、殺菌機制獨特，不易引起耐藥性等優點， 被認為是極具潛力的傳統抗生素替代藥物，具有很大的開發應用前景。
【發明內容】
[0003] 發明目的：為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種具有廣譜高效的抗菌 活性和極低的溶血活性的新型抗菌膚FK及其應用。
[0004] 技術方案：為實現上述技術目的，本發明提出一種抗菌膚FK，所述蝸子抗菌膚FK 由28個氨基酸殘基組成，分子量3358. 20Da，等電點11. 41，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1 所示，具體為：PheiLys2phe化ly4Gly5phe6Leu7LysSLys9Met"T;rpiiLysi2Se;r"Lysi4Leui5Alai6Lysi ^LysisLeu^Ar邑 2〇Ala2iLys22Gly23Arg24Glu25Met26lle27Lys2s。
[0005] 本發明進一步提出了上述抗菌膚FK的制備方法，其特征在于，根據SEQIDNO.l 所示的氨基酸序列，用自動多膚合成儀合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。
[0006] 更近一步地，本發明提出了上述抗菌膚FK在制備抗菌或抑制細菌生長的藥物或 防腐劑或動物飼料或化妝品中的應用。
[0007] 另一方面，本發明提出了一種組合物，所述組合物包含上述抗菌膚FK和藥學上或 美學上可接受的載體或稀釋劑。
[0008] 本發明進一步提出了上述組合物在制備抗菌或抑制細菌生長的藥物或防腐劑或 動物飼料或化妝品中的應用。
[0009] 本發明研究發現，上述抗菌膚FK和含有抗菌膚FK的組合物可W廣泛應用于制備 抗菌制劑、或抑制細菌生長的藥物、或防腐劑、或動物飼料、或化妝品中，如可W用作藥物、 殺菌劑、抗微生物制劑、動物飼料、化妝品和防腐保鮮等領域。
[0010] 有益效果：本發明中的抗菌膚FK具有分子量小、人工合成簡單、抗菌作用廣譜高 效、溶血活性低的優點，具有廣泛的應用前景。
【具體實施方式】
[0011] 根據下述實施例可W更好的理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書所詳細描述的本發 明。
[001引實施例1抗菌膚FK的制備。
[0013] (1)抗菌膚FK的化學合成方法：根據編碼基因推導的氨基酸序列，用自動多膚合 成儀（433A，AppliedBiosystems)合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。
[0014] (2)抗菌膚FK用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點， 用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
[001引抗菌膚FK是基因編碼的一種小分子多膚，由28個氨基酸殘基組成。分子 量3358.200曰，等電點11.41，其氨基酸序列如569 10^.1所示，具體為：?}16七732化0 化ly4Gly5phe6Leu7LysSLys9Meti°TrpiiLysi2Ser"Lysi4Leui5Alai6Lys"LysisLeu"Arg2°Ala2iL ys22Gly23Arg24Glu25Met26lle27Lys2s，分子量 2708. 5Da，等電點 10. 25。
[0016] 實施例2 :抗菌膚FK抗菌活性檢測。
[0017] 微生物菌株接種到MH液體培養基中，37 °C振蕩培養到對數生長期，用新鮮MH液體 培養基將菌液稀釋到2Xl〇5CFU/ml備用。在無菌96孔板（Thermo,美國）各孔中預先加入 100μ1MH液體培養基，然后在第一孔中加入100μ1用MH液體培養基稀釋的抗菌膚FK樣 品溶液，混勻后取100μ1加入第2孔，依次倍比稀釋（參見表1)，自第9孔吸出100μ1棄 去，第10孔做為對照管。
[001引表.1稀釋方法
[0019]
[0020] 將96孔板放置37°C培養箱中緩慢振蕩培養18小時，于600nm波長處測定光吸收， 計算FK樣品對不同微生物的最小抑菌濃度（MinimumInhibito巧Concentration)值。結 果如表2所不。
[0021] 由表2可見，FK對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和真菌均表現出很強的抗菌 活性，其中包括大量臨床分離致病菌。MIC值處于2. 93~85 μ g/ml的范圍。
[002引表2抗菌膚FK抗菌活性
[0023]
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[00巧]實施例:抗菌膚溶血活性測定。-~'
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[0026] 將采集的新鮮C57小鼠血與阿氏液混合抗凝，生理鹽水洗涂2次并重懸成107~ l〇Scell/ml的懸浮液。上述稀釋好的紅細胞懸液與溶解于生理鹽水的抗菌膚FK樣品混合， 37°C保溫30min，再于1000巧m離屯、5min，上清液于540皿測吸收值。陰性對照使用生理鹽 7心陽性對照使用TritonX-100,溶血百分比按W下公式計算：溶血百分比H% =A樣品-A 陰性對照/A陽性對照X100%。
[0027] 結果表明FK濃度為200μg/ml時，溶血百分比為5. 93%。說明抗菌膚FK對哺乳 動物紅細胞具有極低的溶血活性。
[0028] 綜上所述，本發明的抗菌膚FK具有分子量小、人工合成簡單、抗菌作用廣譜高效、 溶血活性低的優點，可W廣泛應用于制備抗菌制劑、或抑制細菌生長的藥物、或防腐劑、或 動物飼料、或化妝品中。
【主權項】
1. 一種抗菌肽FK，其特征在于，所述抗菌肽FK由28個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列 如SEQIDNO. 1 所示。2. 權利要求1所述的抗菌肽FK的制備方法，其特征在于，根據SEQIDNO. 1所示的氨 基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。3. 權利要求1所述的抗菌肽FK在制備抗菌或抑制細菌生長的藥物或防腐劑或動物飼 料或化妝品中的應用。4. 一種組合物，所述組合物包含權利要求1所述的抗菌肽FK和藥學上或美學上可接受 的載體或稀釋劑。5. 權利要求4所述的組合物在制備抗菌或抑制細菌生長的藥物或防腐劑或動物飼料 或化妝品中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種抗菌肽FK，所述抗菌肽FK由28個氨基酸殘基組成，分子量3358.20Da，等電點11.41，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本發明同時公開了上述抗菌肽Fk的制備方法和應用。本發明中的抗菌肽FK具有分子量小、人工合成簡單、抗菌作用廣譜高效、溶血活性低的優點，具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C07K1/00, A61K38/00, A61P31/04, C07K1/20, A23L3/3526, C07K14/00, A61K8/64, A23K20/147
【公開號】CN105254722
【申請號】CN201510738730
【發明人】嚴秀文, 賴仞, 莫國香
【申請人】南京農業大學
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月3日