一種用于治療阿爾茲海默癥的多肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種多肽，該多肽用于預防及治療阿爾茲海默癥，屬于生物醫學技術 領域。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默癥（Alzheimer'sdisease,AD)是一種神經退行性疾病，作為老 年癡呆最常見的一種形式，它具有不可治愈性、進行性以及致命性。其主要的病理學特 征之一就是由于細胞外β-淀粉樣肽（amyloid-β，Αβ)積累引起的老年斑（Senile plaque,SP)(MastersCL,SimmsG,WeinmanNA,etal.Amyloidplaquecoreproteinin AlzheimerdiseaseandDownsyndrome[J].ProceedingsoftheNationalAcademyof Sciences, 1985, 82(12) :4245-4249)。淀粉樣沉積假說將Aβ視為AD發病機理的核心，認 為是Αβ錯誤折疊和自組裝形成的聚集體導致了AD患者腦組織中的一系列病變，并最終導 致癡呆。因此研究者們一度將Αβ聚集抑制劑作為治療AD的可行方法，并設計了小分子、 納米粒子、多肽等不同種類的抑制劑。
[0003] 近年來研究者發現，在老年斑周圍的某些金屬離子（如Fe2+，Cu2+，Ζη2+等）的 濃度明顯要高過正常的腦組織（KeppΚΡ·BioinorganicchemistryofAlzheimer's disease[J] ·Chemicalreviews, 2012, 112 (10) : 5193-5239.)，因此金屬離子在阿爾茲 海默癥的病理學中扮演的角色也得到了廣泛的關注。金屬離子一方面可以改變Αβ的 聚集行為，而Αβ的不同聚集形態產生的毒性作用也不相同，研究者普遍認為寡聚體是 其中毒性最強的組分（KayedR,HeadΕ,ThompsonJL,etal.Commonstructureof solubleamyloidoligomersimpliescommonmechanismofpathogenesis[J].Scien ce, 2003, 300 (5618) :486-489.)。另一方面對于像Cu2+這樣具有一定氧化能力的離子具有 催化產生活性氧組分（Reactiveoxygenspecies，R0S)的能力，也會導致生理毒性的產 生（EskiciG,AxelsenPH.Copperandoxidativestressinthepathogenesisof Alzheimer'sdisease[J] ·Biochemistry, 2012, 51 (32) : 6289-6311.)。因此，金屬離子螯合 劑也成為一種可能的AD的治療手段。
【發明內容】
[0004] 發明目的：現有報道的多肽類Αβ聚集抑制劑或者自身容易發生聚集有一定細胞 毒性，或者只能延緩Αβ的聚集，不能完全抑制其毒性；或者需要很大用量才能起效。因此 我們希望設計一種更高效的雙功能的抑制劑。既可以抑制Αβ的聚集，又可以有一定金屬 離子螯合的能力，抑制Cu2+在AD發生發展中的不良作用。
[0005] 技術方案：為了實現以上目的，本發明采用的技術方案為：
[0006] -種可用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽，該多肽的氨基酸序列為：Gly-Gly-H is-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR)，本發明簡稱該肽為GR。 本發明中該多肽委托吉爾生化（上海）有限公司合成，純度不低于95%。
[0007] 本發明所述的用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預防阿爾茲海默癥 藥物中的應用。
[0008] 所述的用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預防阿爾茲海默癥藥物中 的應用，把用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽和藥學上可接受的載體或促血腦屏障穿越 因子制備成丸劑、膠囊劑、片劑或注射劑制劑。
[0009] 本發明所述的用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽可以通過螯合銅離子和抑制 Αβ聚集兩種功能共同作用，抑制銅離子誘導的Αβ聚集，并有效降低Cu-Αβ復合物的神經 細胞毒性，從而具有預防和治療阿爾茲海默癥的如景。
[0010] 本發明通過等溫滴定微量熱實驗證實了GR可以螯合銅離子，其結合常數約為 1. 38X107M
[0011] 本發明通過硫黃素-T熒光實驗證實了GR可以抑制銅離子誘導的Αβ的聚集。
[0012] 本發明通過透射電子顯微鏡證實了GR可以抑制Cu-Αβ復合物聚集形成纖維。
[0013] 本發明用過ΜΤΤ細胞毒性實驗證明了GR可以有效降低Cu-Αβ復合物對于分化后 的PC-12細胞的細胞毒性。
[0014] 有益效果：本發明和已有技術相比具有以下優點：
[0015] 本發明通過大量實驗證實了GR是一種雙功能的Αβ聚集抑制肽，其既可以抑制 Αβ的聚集，又可以螯合銅離子，從而減小Cu-Αβ復合物的神經細胞毒性。本發明可能形成 預防和治療阿爾茲海默癥的藥物，在生物醫學領域有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1是實施例1中GR與Cu2+結合強度測定的ITC結果圖。
[0017] 圖2是實施例1中GR對于Αβ聚集抑制效果的ThT熒光檢測結果圖。
[0018] 圖3是實施例1中GR抑制Cu-Aβ復合物聚集形成纖維的TEM結果圖
[0019] 圖4是實施例1中GR對于Cu-Aβ復合物神經細胞毒性抑制效果的結果圖。
【具體實施方式】
[0020] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0021] 本說明書中公開的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的 替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個特征只是一系列等效或類似特征中的一個例子 而已。
[0022] 實施例1 :
[0023] 實驗方法：
[0024] 等溫滴定微量熱（ITC) :ITC用于測定銅離子和GR的螯合能力，本實施例中采用的 儀器為MicroCalVP-ITC(GE，USA)。將CuCljPGR溶解于 20mMACES(pH7.4，100mMNaCl) 緩沖液中，分別配制成5mM和2. 5mM溶液。首先，將所用溶液真空脫氣15min。CuCl2溶液 置于上方注射器中，GR溶液置于下方反應池內。滴定過程中，溫度為37 °C，注射器旋轉速度 為307rmp。第一滴延遲時間120s，體積為2μL。之后，每滴5μL，平衡時間為210s，共34 滴。滴定結束，采用Origin7.0軟件采用單結合位點模型擬合分析，最終得到結合常數，反 應熵變和反應焓變。
[0025] 硫黃素T(ThT)熒光分析：ThT熒光用于測定Αβ聚集體重β-sheet結構的含量， 本實施例中采用F-7000熒光光譜儀（Hitachi，Japan)。1)Αβ樣品的預處理：取lmg的Αβ 樣品溶于lmLHFIP中，室溫震蕩，待Αβ逐漸溶解后，用氮氣把HFIP吹干，后用DMS0溶解配 置成lmg/mL的Αβ儲備液于-4°C保存。2)將Αβ儲備液及CuCl2,GR分別用10mMHEPES 緩沖液稀釋至培養所需濃度（Αβ組：Αβ20μΜ，Αβ+Cu組：Αβ20μM+Cu5μΜ，Αβ+Cu+GR 組：Αβ20μM+Cu5μM+GR20μΜ)。37°C，120rmp震蕩孵育。3)測試：在不同時間點，取lmL 樣品與10yL的ThT工作液（lmg/mL)共混，混勻后加入石英比色皿中測定。測量方法為 440nm激發，485nm發射，記錄485nm處的峰值，每組樣品測三次取平均值。
[0026] 透射電子顯微鏡：取10μL培養3天的ThT樣品溶液滴加至銅網上，靜置60s后 用濾紙從反面吸干，后滴加10%的磷媽酸溶液（pH6.8)對樣品進行負染色，靜置60sec后 再用濾紙從反面吸干，晾干后置于干燥器中待測。
[0027] 細胞毒性實驗：本研究中細胞實驗均采用高度分化的PC12細胞，PC12細胞來源 大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤，廣泛用于神經系統疾病的體外研究。使用的培養基為90 %的 DMEM液加10%的胎牛血清再加1%的雙抗，在細胞培養箱中培養（37°C，5%C02)。在細胞 實驗中采用MTT的方法來考察抑制劑GR、Αβ、Αβ-Cu復合物對細胞存活率的影響。
[0028]MTT實驗方法：處于正常狀態的PC12細胞種植在96孔板中，每孔8000細胞，置于 培養箱預先培養24h后細胞給藥，給藥后繼續培養48h后加MTT，過4h后要用酶標儀檢測 細胞存活率（490nm)。各組樣品濃度為（Αβ組：Αβ20μΜ，Αβ+Cu組：Αβ20μM+Cu5μM， Αβ+Cu+GR組：Αβ20μM+Cu5μM+GR20μΜ)。各組樣品均在搖床中37°C孵育一天后進行 細胞給藥。
【主權項】
1. 一種用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽，該多肽的氨基酸序列為：617-617_把8-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR)。2. 權利要求1所述的用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預防阿爾茲海默 癥藥物中的應用。3. 根據權利要求2所述的用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽在治療和預防阿爾茲 海默癥藥物中的應用，其特征在于，把用于治療和預防阿爾茲海默癥的多肽和藥學上可接 受的載體或促血腦屏障穿越因子制備成丸劑、膠囊劑、片劑或注射劑制劑。
【專利摘要】本發明公開了一種多肽結構以及其抑制阿爾茲海默癥患者β-淀粉樣肽(Aβ)聚集的效果。本發明提供的多肽的氨基酸序列為：Gly-Gly-His-Arg-Tyr-Tyr-Ala-Ala-Phe-Phe-Ala-Arg-Arg(GGHRYYAAFFARR,GR)。本發明通過細胞毒性等實驗研究，證實GR可以螯合銅離子并有效抑制β-淀粉樣肽(Aβ)的聚集，明顯減小其由于Aβ聚集引起的神經細胞毒性。因此，本發明提供的多肽有可能用于預防和治療阿爾茲海默癥，在生物醫學領域有很好的應用前景。
【IPC分類】A61P25/28, A61K38/10, C07K7/08
【公開號】CN105237628
【申請號】CN201510789970
【發明人】袁直, 王蔚, 張倩, 劉靜, 胡曉宇
【申請人】南開大學
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年11月17日