一類用于dna原位雜交熒光檢測（fish）技術的生物試劑及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一類基于B0DIPY化合物及FISH方法的癌癥早期檢測試劑及其制備方 法和用途。該試劑可應用FISH方法在基因水平上對各類癌癥進行準確判斷，也可用于特定 基因序列的識別。
【背景技術】
[0002] 癌癥是現在死亡率最高的疾病之一。癌癥死亡率高的一個重要原因是早期診斷 困難，如果能夠實現癌癥的早期診斷并及時手術摘除，癌癥是可以治愈的；遺憾的是--約 2/3的癌癥患者發現時已經到了中晚期，腫瘤變大手術治療困難，同時癌細胞可能已經發生 轉移。因此，癌癥的早期篩檢變得尤為重要。
[0003]突光原位雜交法（Fluorescencein-situhybridization，FISH法）在生物醫學領 域得到了廣泛應用。FISH方法利用了DNA分子鏈中核酸堿基序列的識別功能，并以熒光分 子（基團）標記作為熒光探針，實現了DNA的高分辨和高靈敏檢測。由于FISH方法基于基 因序列（遺傳密碼）的識別，能夠檢測癌癥基因的存在，為其早期診斷和預防提供依據。這 一技術利用了DNA堿基的精確互補配對過程，因而對癌癥基因的檢出準確率較高。同時這 項技術檢出限低，lcc血液中只要有一顆癌細胞就能夠檢測出來。
[0004] 二吡咯硼烷化合物B0DIPY自1968年首次報道以來就受到廣泛的關注。B0DIPY與 傳統熒光化合物相比，具有吸收強，量子效率高，光譜窄，易于修飾，光譜范圍可調等優點。 正因為上述優點的存在，使得B0DIPY類化合物能夠廣泛應用于環境和生物檢測方面。基于 這類染料的探針具有靈敏度高，檢出限低，抗干擾強等優勢。用B0DIPY作為檢測探針的信 號輸出端，利用B0DIPY類染料高熒光量子效率的特點，可以大大提高檢測極限；因其較窄 的發射光譜，使得其熒光色純度高，能夠有效地降低干擾，提高準確度。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一類用于癌癥基因檢測的FISH熒光化合物。
[0006] 本發明的另一目的在于提供用于癌癥基因檢測的FISH熒光化合物的制備方法。
[0007] 本發明的再一目的在于提供一類能夠用于DNA堿基標記的熒光化合物及其制備 方法。
[0008] 本發明的再一目的在于提供用于癌癥基因檢測的FISH熒光化合物的用途。
[0009] 本發明提供了一種FISH熒光化合物，其具有如下通式II的結構。
[0010]
[0011] 其中，F1為熒光分子部分，其結構為如下述通式III所示：
[0012]
[0013] 其中，X!、X2a立選自F、烷基、烷氧基；&、1?2、1?3、1?5、1? 6、1?7獨立的選自：!1、烷基、-烷 基-coo-烷基、-芳基-coo-烷基、-烷基-coo-芳基、-烷基-oco-烷基、-芳基-oco-烷 基、-烷基-0C0-芳基、-C0-NH-烷基、-C0-NH-芳基、氨基、腈基、烯基、炔基、環烷基、芳基、 芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、雜環基、雜環烷基；
[0014] R獨立選自亞烷基、-烷基-C00-烷基_、-芳基-C00-烷基_、-烷基-C00-芳 基_、-烷基-C0NH-烷基-、-烷基-C0NH-芳基-、-芳基-C0NH-烷基-、-芳基-C0NH-芳 基_、-烷基-C0NH-芳烷基-、-芳烷基-C0NH-烷基-、-芳烷基-C0NH-芳烷基-、-芳 基_芳烷基_雜芳基_雜芳烷基 _雜環基_雜環烷基_。
[0015] 上述Xi、X2、&、R2、R3、R5、R6、R7、R中定義的基團可以進一步被取代基取代，所述取 代基可以為烷基、烷氧基、鹵素、硝基等。
[0016] 所述的烷基代表碳原子數為1-10,優選1-6的直鏈或支鏈烷基，例如，甲基、乙基、 丙基、丁基、異丁基、叔丁基等。
[0017] 所述的烯基代表碳原子數為2-10,優選2-6的直鏈或支鏈烯基，例如，乙烯、丙烯、 丁烯等。
[0018] 所述的炔基代表碳原子數為2-10,優選2-6的直鏈或支鏈炔基，例如，乙炔、丙炔、 丁炔等。
[0019] 所述的環烷基代表具有3-8個，優選3-6個環原子的碳環，例如環戊烷基、環己烷 基或環庚烷基。
[0020] 所述的芳基指具有6-20個碳原子的單環、多環芳族基團，代表性的芳基包括：苯 基、蔡基等。
[0021] 所述的雜芳基指具有1-20個碳原子、至少1個，優選1-4個選自N、S、0雜原子的 單環或多環雜芳族基團，代表性的雜芳基包括：吡咯基、吡啶基、嘧啶基、咪唑基、噻唑基、吲 噪基等。
[0022] 所述的雜環基指具有1-20個碳原子、至少1個，優選1-4個選自N、S、0雜原子的 飽和或不飽和的單環或多環雜環基團，如氮雜環基，氮、氧雜環基，代表性的雜環基包括：四 氫吡咯基、四氫吡啶基、哌嗪基、嗎啉基等。
[0023] 所述氨基代表基團-NR^，其中，R1獨立的選自H、烷基、芳基、雜芳基、雜環基。
[0024] 根據本發明，優選的，&、R2、R3、R5、R6、R7獨立的選自：H、烷基、-烷基-C00-烷 基、-芳基-C00-烷基、-烷基-0C0-烷基、-芳基-0C0-烷基、-C0-NH-烷基、-C0-NH-芳基、 芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基。
[0025] 根據本發明，優選的，R獨立選自亞烷基、-烷基-C00-烷基_、-芳基-C00-烷 基_、-烷基-C00-芳基_、-烷基-C0NH-烷基-、-烷基-C0NH-芳基-、-芳基-C0NH-烷 基_、-烷基-C0NH-芳烷基-、-芳烷基-C0NH-烷基-、-芳基-、-芳烷基_。
[0026] 根據本發明，所述F1優選為如下通式Ilia的結構。
[0027]
[0028] 本發明特別優選的式II化合物選自：
[0029]
[0030] 本發明還提供了一種通式II化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0031]
*2
[0032] 其中，FI、R如前面所述。
[0033] 1)dUTP的汞化
[0034] 將dUTP的水溶液與Hg(OAc)2的水溶液混合，然后加熱攪拌，之后冷卻；將NaCl加 入上述冷卻后的溶液，生成白色沉淀，即得到產物dUTP-Hg;
[0035]2)由dUTP-Hg制備dUTPN
[0036] 將步驟1)中得到的dUTP-Hg配成溶液；然后將所述dUTP-Hg溶液與烯丙胺溶液混 合，得到dUTPN;
[0037] 3)由dUTPN制備通式II化合物（即FISH試劑）
[0038] 將通式I的熒光染料溶于有機溶劑，然后加入dUTPN的溶液，反應得到通式II化 合物。
[0039] 根據本發明，在步驟1)中，將混合溶液加熱攪拌，之后停止加熱繼續攪拌，然后再 倒入冰水中冷卻。所述加熱溫度優選為50°C，加熱攪拌的時間優選3小時。所述倒入冰水 中冷卻至0°C。
[0040] 根據本發明，在步驟1)中，將最后得到的白色沉淀過濾收集，分別用NaCl溶液和 水洗后，再用乙醇洗滌，然后真空干燥。
[0041] 根據本發明，在步驟2)中，將步驟1)中得到的dUTP-Hg加入LiOAc/HOAc緩沖溶 液中配成dUTP-Hg溶液，所述LiOAc/HOAc緩沖溶液的配制優選如下：將LiOAc·Η20溶于水 并加HOAc調節pH(優選的，調節pH= 5)，配成LiOAc/HOAc緩沖溶液體系；所述烯丙胺優 選為重蒸后的烯丙胺（b.p. =55°C);所述烯丙胺溶液為烯丙胺的醋酸水溶液，烯丙胺的醋 酸水溶液優選將重蒸后的烯丙胺與醋酸水溶液混合配成；所述反應溫度優選為室溫，反應 時間優選16-24小時。
[0042] 根據本發明，在步驟2)中，優選加入Li2PdCl4引發反應。
[0043] 根據本發明，在步驟3)中，dUTPN溶液的配制是將dUTPN溶于NaB207緩沖溶液中， 所述NaB207緩沖溶液優選pH= 8. 5,濃度優選為0. 1M，所述有機溶劑優選為DMF，所述反應 時間優選為14-16小時。
[0044] 根據本發明，在步驟3)中，將得到的通式II化合物用HPLC進行分離和純化。優 選的HPLC分離條件為--7K:甲醇=5 :4,流速15mL/min。
[0045] 本發明還提供一類用于DNA堿基標記的熒光化合物，其可以用于制備通式II化合 物，該熒光化合物具有如下通式I的結構。
[0046]
[0047] 其中，F1為熒光分子部分，其結構為如下述通式III所示：
[0048]
[0049] 其中，立選自F、烷基、烷氧基；&、1?2、1?3、1?5、1? 6、1?7獨立的選自：!1、烷基、-烷 基-coo-烷基、-芳基-coo-烷基、-烷基-coo-芳基、-烷基-oco-烷基、-芳基-oco-烷 基、-烷基-0C0-芳基、-C0-NH-烷基、-C0-NH-芳基、氨基、腈基、烯基、炔基、環烷基、芳基、 芳烷基、雜芳基、雜芳烷基、雜環基、雜環烷基；
[0050] R獨立選自亞烷基、-烷基-C00-烷基-、-芳基-C00-烷基-、-烷基-C00-芳 基_、-烷基-C0NH-烷基-、-烷基-C0NH-芳基-、-芳基-C0NH-烷基-、-芳基-C0NH-芳 基_、-烷基-C0NH-芳烷基-、-芳烷基-C0NH-烷基-、-芳烷基-C0NH-芳烷基-、-芳 基_芳烷基_雜芳基_雜芳烷基 _雜環基_雜環烷基-等。上述Xi、X2、R中 定義的基團可以進一步被取代基取代，所述取代基可以為烷基、烷氧基、