一種過表達克氏原螯蝦nadh脫氫酶亞基iii的基因工程菌的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種過表達克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III的基因工程菌，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002]“眼柄切除誘導蝦蟹類甲殼動物卵巢快速發育成熟”(簡稱蝦蟹卵巢“眼柄切除效應”)存在相似的分子機制，闡明分子機制具有重要科學意義和應用前景。如何實現無/弱副作用的人工卵巢發育調控一直是經濟蝦蟹養殖的重要難題之一。目前人們雖已摸索出不少促蝦蟹卵巢快速成熟方法，如控溫、控光、強化營養條件、激素處理等，但眼柄切除仍是不少蝦蟹人工育苗生產中促進親蝦卵巢快速成熟及產卵的最常用、最有效方法。目前在蝦蟹繁殖季節，人工切除雌性蝦蟹的單側眼柄用以促進卵巢同步發育、快速成熟，提高抱卵量，已在不少國家較為普遍應用于多種海洋和淡水經濟蝦蟹(如斑節對蝦、大西洋龍蝦、鋸緣青蟹等)的規模化養殖中。然而，應用實踐中會出現無法避免的副作用:切除眼柄后易致親體蛻皮周期縮短、死亡率上升、卵子質量下降等不良后果。蝦蟹卵巢“眼柄切除效應”存在相似的分子機制，深入闡明該分子機制將非常有助于發掘到新的、更合理的人工生殖調控分子靶點，從而指導發展可替代眼柄切除、無/弱副作用的人工卵巢促熟思路和方法，對于經濟4下蟹類人工養殖業的發展具有重要價值。克氏原螯4下(Procambarus clarkii)，俗稱龍蝦、小龍蝦，隸屬節肢動物門、甲殼綱、十足目，是具較高經濟價值的水產養殖品種之一，是研究蝦蟹類卵巢“眼柄切除效應”分子機制的一種非常好的代表動物。
[0003]NADH脫氫酶是線粒體內膜上電子傳遞鏈的組成部分，含多個亞基，催化電子從NADH傳遞給輔酶Q，參與細胞能量代謝。我們前期的研究發現NADH脫氫酶在克氏原螯蝦眼柄切除后的中期及晚期表達水平均逐漸提高，至卵巢發育至成熟期時(?15day)表達水平達到最高，與卵巢成熟標志物vitellogenin動態表達模式類似，表明其在克氏原螯4下“眼柄切除效應”過程中具有重要功能。為深入探究NADH脫氫酶在克氏原螯蝦“眼柄切除效應”誘導卵巢快速發育成熟中的作用和調控模式，首先需要制備大量高活性的NADH脫氫酶蛋白。本專利使用大腸桿菌重組表達系統，構建高效過表達克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III蛋白的基因工程菌，為后續深入研究克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應”的分子機制奠定基礎。
【發明內容】
[0004]本發明要解決的技術問題是提供一種過表達克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III的基因工程菌，是將基因nad3導入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。
[0005]所述基因nad3的序列是根據GeneBank中來源于克氏原螯4下(Procambarusclarkii)的Sequence ID:AFQ31583的序列進行全基因化學合成得到。
[0006]本發明的第二個目的在于提供上述基因工程菌的構建方法，成功過表達獲得了克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III蛋白，其步驟如下:
[0007](I)設計引物 nad3-l: (5 ' ~TCAGGAGGTACCATTTATATTTTAATAACAAGTG~3 ')和nad3-2: (5 ' -ACTGAGAAGCTTCTACTCATTCCACTCCAGAGCTC-3 ')，利用 PCR 將克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III的cDNA編碼框5 ’和3 ’兩側分別引入Kpn I和Hind I 11限制性酶切位點(下劃線顯示)；
[0008](2)通過雙酶切、分子連接等基因操作將nad3基因插入到表達質粒pColdll，構建重組質粒 pColdII_nad3 ；
[0009](3)隨后將pColdI1-nad3轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉化子并進行測序驗證。
[0010]本發明選取大腸桿菌冷休克表達載體pColdll，構建了重組表達載體PColdI1-nad3，利用大腸桿菌系統成功高可溶性表達獲得了克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III蛋白，并對表達的NADH脫氫酶亞基III蛋白進行了純化及免疫印跡分析。
[0011]本發明相比現有技術的有益效果:本發明首次以大腸桿菌為表達宿主實現了克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III的高效重組表達，重組表達的可溶性NADH脫氫酶亞基III蛋白的表達量約占表達株BL21(DE3)菌體總蛋白量的55%，大部分為可溶性狀態，目前國際上尚未見任何有關重組表達克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III蛋白的報道。
【具體實施方式】
[0012]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。
[0013]下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。
[0014]在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。
[0015]實施例1克氏原螯蝦nad3基因的獲得
[0016]根據GenBank數據庫中已公開的克氏原螯4下nad3基因(Sequence ID:AFQ31583)序列進行全基因化學合成。
[0017]實施例2克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III的大腸桿菌重組表達、純化及免疫印跡鑒定
[0018]設計引物nad3-l:(5 ' ~TCAGGAGGTACCATTTATATTTTAATAACAAGTG~3 ')和nad3-2: (5 ' -ACTGAGAAGCTTCTACTCATTCCACTCCAGAGCTC-3 ')，利用 PCR 將克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III的cDNA編碼框5’和3’兩側分別引入Kpn I和Hind I II限制性酶切位點(下劃線顯示)，通過雙酶切、分子連接等基因操作將nad3基因插入到商業化表達質粒pColdll，構建重組質粒pColdI1-nad3。隨后將pColdII_nad3轉化大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉化子并進行測序驗證，隨后利用IPTG進行重組NADH脫氫酶亞基III蛋白的誘導表達。培養基成分為:胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化鈉(NaCl) 10g/L，pH 7.4。
[0019]誘導表達條件為:將重組表達質粒pColdI1-nad3轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。含重組質粒的工程菌在37°C條件下劇烈震蕩培養至OD6。。?0.5，隨后轉入15°C培養并加入終濃度為0.3mM的IPTG，誘導表達20h，轉速160rpm。收集菌體，SDS-PAGE分析全菌總蛋白顯示，基因工程菌經誘導后有明顯的特異表達條帶，條帶分子量與預期大小分子量?13kD —致。在此條件下，重組蛋白的表達量約占菌體總蛋白量的55%，大部分為可溶性狀態。誘導表達后，超聲破碎菌體，利用Ni+柱親和層析法純化得到可溶性NADH脫氫酶亞基III，咪唑洗脫濃度為400mM。進一步利用免疫印跡法對重組NADH脫氫酶亞基III進行表達鑒定分析。上述相關方法均采用常規操作步驟。
[0020]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種高效表達克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III蛋白的基因工程菌，是將nad3基因導入E.coli BL21(DE3)得到的基因工程菌。2.根據權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述nad3基因的核苷酸序列如GeneBank 中 Sequence ID:AFQ31583 的序列所不。3.一種構建權利要求1所述基因工程菌的方法，其步驟如下: (1)設計引物nad3-l:(5' -TCAGGAGGTACCATTTATATTTTAATAACAAGTG-3')和 nad3_2: (5' -ACTGAGAAGCTTCTACTCATTCCACTCCAGAGCTC-3')，利用 PCR 將克氏原螯蝦 NADH 脫氫酶亞基III的cDNA編碼框5’和3’兩側分別引入Kpn I和Hind I II限制性酶切位占.V， (2)通過雙酶切、分子連接等基因操作將nad3基因插入到表達質粒pCoI dll，構建重組質粒 pColdII_nad3 ； (3)隨后將PColdI1-nad3轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，通過氨芐抗生素平板篩選陽性轉化子并進行測序驗證； 所述限制性酶切位點以加下劃線的字母表示。4.一種以權利要求1所述基因工程菌生產NADH脫氫酶亞基III蛋白的方法，其步驟如下:將重組表達質粒pColdI1-nad3轉化大腸桿菌BL21(DE3)。含重組質粒的工程菌在37°C條件下劇烈震蕩培養至OD6。。?0.5，隨后轉入15°C培養并加入終濃度為0.3mM的IPTG，誘導表達20h，轉速160rpm。收集菌體，SDS-PAGE分析全菌總蛋白顯示，基因工程菌經誘導后有明顯的特異表達條帶，條帶分子量與預期大小分子量?13kD—致。在此條件下，重組NADH脫氫酶亞基III蛋白的表達量約占菌體總蛋白量的55%，大部分為可溶性狀態。
【專利摘要】本發明涉及一種利用大腸桿菌表達系統胞內生產克氏原螯蝦NADH脫氫酶亞基III蛋白的方法，屬于基因工程技術領域。本發明通過全基因合成獲得nad3基因，構建重組表達載體pColdII-nad3并轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)實現高效表達，為后續針對克氏原螯蝦卵巢“眼柄切除效應”分子機制的深入研究奠定了重要基礎。
【IPC分類】C12N9/02, C12N15/70, C12N1/21, C12R1/19
【公開號】CN105219689
【申請號】CN201510651431
【發明人】管政兵, 水燕, 廖祥儒, 蔡宇杰, 伊海希
【申請人】江南大學
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年10月10日