一種野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于野生磨茹菌絲分離純化技術領域，具體設及一種野生己楚磨茹菌絲的 分離純化方法。
【背景技術】
[0002] 新疆野生食用菌資源相對較少，著名的食用菌除了羊肚菌、阿魏磨外，還有在喀什 地區的"己楚磨茹"。它W質嫩味美、營養豐富而著稱。因己楚磨茹迄今為止未被馴化成功， 隨著人們對具有特色香味和鮮味己楚磨茹及營養的認識，需求量日益增加，市場價格大幅 增長，野生數量由于當地人們滅絕性的采集而逐年降低，運種狀況嚴重威脅己楚磨茹物種 的存亡。
[0003] 但經多年的研究發現，己楚磨茹菌絲純化難度極大，多數分離的菌絲是混合了桿 狀和鑲刀狀兩種雜菌的雜合菌絲，由此導致研究不能繼續深入。找到一種能夠純化己楚磨 茹菌絲的新方法成了深入研究己楚磨茹的瓶頸。
[0004] 所W，在傳統的菌絲分離中引進更為有效、準確的野生己楚磨茹菌絲分離和純化 的技術和方法對于己楚磨茹物種的保存W及消費者的需求是有著非常重大的意義的。
【發明內容】
陽〇化]本發明的目的是提供一種野生己楚磨茹菌絲的分離純化方法，該方法通過野生的 己楚磨茹組織或抱子分離培養、純化培養等步驟，實現了野生己楚磨茹菌絲的分離和純化， 具有純化度高，純化準確、易于準確鑒定的優點。
[0006] 本發明的目的可W通過W下技術方案來實現：
[0007] 與現有技術相比，本發明的有益效果在于：
[0008] 一種野生己楚磨茹菌絲的分離純化方法，其步驟包括：
[0009] (1)、將野生己楚磨茹組織或彈射的抱子于PDA培養基上培養6-8天獲得雜合菌 絲；
[0010] (2)、取步驟（1)中的雜合菌絲于特色培養基上培養7-10天，獲得單一的純合絲狀 菌絲；優選的，本步驟的培養溫度為20-25°C。 W11] 做、挑取步驟似中的菌絲轉接到PDA培養基上培養6-8天即可。
[0012] 所述步驟（1)中，野生己楚磨茹組織為野生己楚磨茹子實體的菌肉；將菌肉或彈 射的抱子，在開放環境下放置于滅菌的PDA培養基上，25°C條件下，室內培養7天。優選的， 所述野生己楚磨茹子實體的菌肉與PDA培養基的培養重量為1:90-100 ;所述野生己楚磨茹 彈射的抱子無菌水的接種量為0. 1-0. 5%〇。經過7天的培養后有菌絲長出，取長出的菌絲于 事先滴有蒸饋水或5%KOH溶液的蓋玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲情況，發現 有=種菌絲形態，一種絲狀，一種鑲刀狀，另一種為桿狀，所W，經過步驟（1)的培養，培養 出的菌絲為雜合菌絲。
[0013] 優選的，所述野生己楚磨茹子實體的菌肉為菌柄與菌蓋結合部，其組織生長活躍， 不與外部空氣接觸。
[0014] PDA培養基的配方為馬鈴馨（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g，蒸饋水 1000血。
[0015] 所述步驟（2)中，特色培養基由葡萄糖、硫胺素、硫酸慶大霉素、青霉素、新霉素和 蒸饋水組成。優選的，所述特色培養基的葡萄糖濃度為0. 02g/mL;所述特色培養基中的的 硫胺素、硫酸慶大霉素、青霉素、新霉素的濃度均為0.OOlmg/mL。
[0016] 所述特色培養基的配置方法為，將葡萄糖、瓊脂和蒸饋水滅菌后倒入平皿，冷卻至 60°CW下后加入硫胺素、硫酸慶大霉素、青霉素和新霉素，混合均勻倒入平板至凝固待用。
[0017] 該特色培養基的優點在于能抑制鑲刀狀和桿狀W及細菌等雜菌的生長而不阻礙 絲狀菌絲的生長，便于絲狀真菌菌絲的快速生長和分離。
[0018] 所述步驟（2)中，雜合菌絲的接種量為1-2%。。合適的雜合菌絲接種量，有利于所 要的菌絲快速生長，快速分離。
[0019] 所述步驟（3)中，菌絲的接種量為1-2%。。選擇合適的接種量再次純合培養，有利 于所要分離的菌絲更快速的生長，恢復其原有的活力。
[0020] 將步驟（3)中獲得的純合絲狀菌絲通過顯微鏡檢和分子序列鑒定進行純合鑒定， 鏡檢和序列比對相符即已純化，反之則不純。
[0021] 1、本發明提供了野生己楚磨茹菌絲純化方法，采用改良的CTAB法提取純化后的 DNA，并進行ITS序列測序，得到的序列和已知的己楚磨茹子實體的ITS序列進行比對，序列 相似度達99%W上，為人工培養己楚磨茹奠定了基礎。
[0022] 2、本發明提供的野生己楚磨茹菌絲的分離純化方法，具有純化性高、純化精確、易 于準確鑒定的特點。
[0023] 3、本發明的野生己楚磨茹菌絲純化工藝簡單、易于操作、適用性強。
【附圖說明】
[0024] 圖1為實施例1中的雜合菌絲圖。
[00巧]圖2為實施例1中的單一的純合絲狀菌絲圖。
【具體實施方式】
[00%] 下面結合實施例，對本發明作進一步說明： 陽〇27] 實施例1
[0028] 培養基的制備 陽0巧]PDA培養基：馬鈴馨（去皮）200g、葡萄糖20g、瓊脂15-20g，蒸饋水1000血。
[0030] 特色培養基：將葡萄糖、瓊脂和蒸饋水配置成1000血溶液，滅菌后倒入平皿，冷卻 至60°CW下后加入硫胺素lOmg、硫酸慶大霉素lOmg、青霉素IOmg和新霉素IOmg,混合均勻 后倒入平板至凝固待用。
[0031] 純化步驟：
[0032] 取野生己楚磨茹（采摘自新疆喀什己楚縣）的子實體菌肉（菌蓋和菌柄結合 部）0. 1g培養于9g的PDA培養基中，25°C條件下，室內培養7天。
[0033] 經過7天的培養后有菌絲長出，取長出的菌絲于事先滴有蒸饋水或5 %KOH溶液的 蓋玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲情況，發現有=種菌絲形態，一種絲狀，一種鑲 刀狀，另一種為桿狀，所W，經過上述步驟的培養，培養出的菌絲為雜合菌絲，具體如圖1所 /J、-O
[0034] 在滅菌的超凈工作臺中挑取含有雜合菌絲的菌絲塊，轉接到特色培養基上，接種 量為1%。，25°C溫度條件下培養7-10天，獲得單一的純合絲狀菌絲。
[0035] 挑取上述單一的純合絲狀菌絲轉接到PDA培養基上培養7天，接種量為1%。，于事 先滴有蒸饋水或KOH溶液的蓋玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲情況，發現僅有一 種絲狀菌絲形態，具體如圖2所示（該絲狀菌絲直徑4-8ym，細長型，無色透明，菌絲有隔 膜，菌絲內部具有油狀液滴）。
[0036] 分子序列鑒定：采用改良的CTAB法提取上述純化后的菌絲DNA，并進行ITS測序， 得到的序列和已知的己楚磨茹子實體的ITS序列進行比對，序列相似度達99%W上則為己 楚磨茹的菌絲。
[0037] 測定的純化后的菌絲ITS序列如下。
[0039] 經過ITS序列進行比對，序列相似度達99%W上，本發明培養的菌絲為己楚磨茹 的菌絲。 W40] 實施例2 [0041] 培養基的制備 陽0創PDA培養基與特色培養基的制備同實施例1。 陽0創純化步驟：
[0044] 取野生己楚磨茹彈射的抱子無菌水Iml于PDA培養基中，25°C條件下，室內培養7 天。
[0045] 經過7天的培養后有菌絲長出，取長出的菌絲于事先滴有蒸饋水或5%KOH溶液的 蓋玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲情況，發現有=種菌絲形態，一種絲狀，一種鑲 刀狀，另一種為桿狀，所W經過上述步驟的培養，培養出的菌絲為雜合菌絲。
[0046] 在滅菌的超凈工作臺中挑取含有雜合菌絲的菌絲塊，轉接到特色培養基上，接種 量為2%。，25°C溫度條件下培養7-10天，獲得單一的純合絲狀菌絲。
[0047] 挑取上述單一的純合絲狀菌絲轉接到PDA培養基上培養7天，接種量為2%。，于事 先滴有蒸饋水或KOH溶液的蓋玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲情況，發現僅有一 種絲狀菌絲形態，該絲狀菌絲直徑4-8ym，細長型，無色透明，菌絲有隔膜，菌絲內部具有油 狀液滴。
[0048] 分子序列鑒定：采用改良的CTAB法提取上述純化后的菌絲DM,并進行ITS測序， 得到的序列和已知的己楚磨茹子實體的ITS序列進行比對，序列相似度達99%W上，所W 本制備方法培養出的菌絲為己楚磨茹的菌絲。
[0049] W上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限于該實施例所公開的 內容。所W凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的范 圍。
【主權項】
1. 一種野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其步驟包括： (1) 、將野生巴楚蘑菇組織或彈射的孢子于PDA培養基上培養6-8天獲得雜合菌絲； (2) 、取步驟（1)中的雜合菌絲于特色培養基上培養7-10天，獲得單一的純合絲狀菌 絲； (3) 、挑取步驟（2)中的菌絲轉接到PDA培養基上培養6-8天即可。2. 根據權利要求1所述的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述步驟 (1) 中，野生巴楚蘑菇組織為野生巴楚蘑菇子實體的部分菌肉；將菌肉或彈射的孢子，在開 放環境下放置于滅菌的PDA培養基上，25°C條件下培養7天。3. 根據權利要求2所述的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述野生 巴楚蘑菇子實體的菌肉與PDA培養基的重量為1:90-100 ;所述野生巴楚蘑菇彈射的孢子的 無菌水接種量為0. 1-0. 5%。。4. 根據權利要求1所述的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述步驟 (2) 中，特色培養基由葡萄糖、硫胺素、硫酸慶大霉素、青霉素、新霉素、蒸餾水和瓊脂組成。5. 根據權利要求4所述的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述特色 培養基的葡萄糖濃度為〇. 〇2g/mL;所述特色培養基中的的硫胺素、硫酸慶大霉素、青霉素、 新霉素的濃度均為〇. 〇〇lmg/mL。6. 根據權利要求1所述的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述步驟 (2) 中，雜合菌絲的接種量為1-2%。。7. 根據權利要求1所述的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，其特征在于：所述步驟 (3) 中，所述菌絲的接種量為1-2%。。
【專利摘要】本發明屬于野生蘑菇菌絲分離純化技術領域，具體涉及一種野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，首先將野生巴楚蘑菇組織或彈射的孢子于PDA培養基上培養6-8天獲得雜合菌絲；然后取雜合菌絲于特色培養基上培養7-10天，獲得單一的純合絲狀菌絲；挑取該純合的菌絲轉接到PDA培養基上培養6-8天即可。采用改良的CTAB法提取純化后的DNA，并進行ITS序列測序，得到的序列和已知的巴楚蘑菇子實體的ITS序列進行比對，序列相似度達99％以上，為人工培養巴楚蘑菇奠定了基礎。本發明提供的野生巴楚蘑菇菌絲的分離純化方法，具有工藝簡單、易于操作、純化性高、純化精確、易于準確鑒定的特點。
【IPC分類】C12N1/14, C12R1/645
【公開號】CN105219652
【申請號】CN201510593514
【發明人】李傳華
【申請人】上海市農業科學院
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2015年9月17日