一種依非巴特的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物合成領域，具體設及一種新的依非己特的制備方法。
【背景技術】
[0002] 依非己特（Eptifibatide)是人工合成的環狀屯膚，為糖蛋白（GP)IIb/IIIa受體 (血小板凝血因子I受體）括抗劑，能夠阻滯血小板聚集，具有非常強大的抗血小板聚集作 用。其膚序結構如下：
CAS# :148031-34-9 ;分子式：C35H49Nu〇9S2;分子量：831. 96。
[0003] 依非己特為糖蛋白（GP)IIb/IIIa受體（血小板凝血因子I受體）括抗劑。能選 擇性、可逆性抑制血小板聚集的最終共同通路（血漿凝血因子I與GPIIb/IIIa結合），可 逆轉因血栓形成而導致的缺血狀態該品種由美國COR化erapeutics公司開發，1998年在 美國上市，商品名Intergrelin。能夠阻滯血小板聚集，具有非常強大的抗血小板聚集作用， 用于急性冠脈綜合征及經皮冠狀動脈介入治療。
[0004] 依非己特的制備方法，國內外已有文獻和專利報道，中國專利CN1500805A、 CN1858060A、CN102584944A公開了依非己特的制備方法，其制備方法都采用Fmoc固相 合成法，W氨基樹脂為開始的載體樹脂，依次接入保護氨基酸，所得膚樹脂酸解而得還原 型依非己特粗品，再氧化得到依非己特。中國專利CN1500805A，原料使用了Mpr度Zl) 和Fmoc-Harg任bf)-〇H，由于Mpr度zl)上的基團Bzl酸解條件苛刻，依非己特膚樹脂 須采用酸解試劑（TFA/皿r/HAc/TIS/邸T)，很容易產生雜質，同時Fmoc-化rg任bf)-OH 價格較貴；中國專利CN1858060A，原料使用了片段Mpr燈rt)-化rg(B0C2) -0H，但片段 MpHht)-化rg度oC2)-0H的制備較繁瑣。中國專利CN102584944A原料采用了兩個片段 MpHTrtorAcm)-化rg-OH和Fmoc-Gly-Asp(01:Bu)-〇H，工藝復雜。本發明的優點采用了 Fmoc-切S巧1)和片段Mpr巧2) -Harg,既避免了使用價格高的Fmoc-Harg任bf) -0H，同時使膚 樹脂酸解條件更為溫和，能有效地避免雜質的產生，產品純度可達99. 5%W上，具有產業化 前景。
【發明內容】
[0005] 本發明旨在提供一種新的依非己特的制備方法，該制備方法采用了Fmoc-切S巧1) 和片段Mpr(Rz)-Harg,既避免了使用高價格的原料Fmoc-Harg任bf)-〇H，同時使膚樹脂酸解 條件更為溫和，能有效地避免雜質的產生，提高產品收率和純度，有利于規模化生產，具有 產業化前景。
[0006] 本發明依非己特的制備方法，（1)、W保護氨基酸、片段和氨基樹脂為原料，采用多 膚固相合成法依次偶聯得到膚樹脂X-Gly-Asp(0巧11) -T;rp(Boc) -pro-切S巧1)-氨基樹脂， 其中Rl為化t、Mtt、Mmt或Dmt;X為Mpr巧2)-化rg，R2為化t、Mmt或Dmt;似、加入酸解試 劑（TFA/TIS/邸T/UO)酸解，用乙酸沉淀并收集還原型依非己特粗品；（3)、將還原型依非 己特粗品氧化，得依非己特粗品；(4)、將依非己特粗品通過Cis柱分離純化，獲得目標產物 依非己特。
[0007] 本發明所述的氨基樹脂，可選I^ink Amide樹脂、Rink Amide AM樹脂、Rink MBHA 樹脂和Sieber樹脂中的一種，優選為化nk Amide AM樹脂。
[0008] 進一步地，所選氨基樹脂取代值為0. 4~1. 2mmol/g樹脂，優選為0. 5~1.Ommol/ g樹脂。
[0009] 本發明所述的保護氨基酸為Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(01:Bu)-〇H、 Fmoc-1'巧度〇。）-0山尸111〇。斗1'〇-0山尸1]1〇。-切3化）-0]^;其中而為1'1'1:、11:1:、11111:或01111:;所述 片段為Mpr巧2)-化rg-OH或其形成的鹽；Rz為化t、Mmt或Dmt。
[0010] 其中，片段Mpr巧2)-化rg-OH結構：
進一步地，片段MprOg-化rg-OH對應W下表1中結構： 表1為片段Mpr巧2)-化rg-OH所對應的結構
進一步地，片段Mpr巧2)-Harg-OH還包含它所形成的鹽，如鹽酸鹽、堿金屬鹽、有機胺鹽 等。
[00川 其中，保護Fmoc-切S化)-OH結構：
進一步地，保護氨基酸Fmoc-切S巧I)-OH對應W下表2中結構： 表2保護氨基酸Fmoc-切S(Ri)-OH所對應的結構
進一步地，本發明所述的保護氨基酸、片段中Mpr(Rz)-Harg-OH有3種結構可選，Fmoc-切S巧1) -OH有4種結構可選，保護氨基酸、片段的組合方式有12種。優選的，保護氨基 酸、片段為]^口1'(11111:)-化巧-0比肥1少1]1〇。-617-姐[少1]1〇。-/\3口（01:811)-0]^少1]1〇。-1'巧度〇。）-0山 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-0H。
[0012] 本發明所述的偶聯合成法具體包含=步反應：（1)、保護氨基酸或片段的活化反 應：將保護氨基酸或片段，加溶劑攬拌溶解，在攬拌冰水冷卻下加入偶聯劑，反應0. 25~2 小時，得保護氨基酸或片段的活化醋溶液。（2)、保護氨基酸或片段與樹脂的偶聯反應：將 保護氨基酸或片段的活化醋溶液加入氨基樹脂或前一步反應得到的去Fmoc保護的膚樹脂 中，室溫攬拌偶聯反應，用巧=酬檢測反應情況，每隔1小時監測1次，直至完全(巧=酬檢 測樹脂呈無色)，反應完全后，用溶劑洗涂6次，抽干。（3)、Fmoc基團的脫除反應：加入脫除 保護基團Fmoc的試劑的溶液，攬拌反應0. 25~1小時，抽干；用溶劑洗涂6次，抽干，得膚 樹脂。
[001引 本發明所述偶聯所用的偶聯劑為DCC/HOBt、DCC/HOAt、DIC/HOBt、DIC/HOAt、皿TU/ DIPEA、皿TU/NMM、皿TU/TEA、TBTU/DIPEA、TBTU/NMM、TBTU/TEA、HATU/DIPEA、HATU/NMM、HATU/TEA中的一種。優選為DIC/冊Bt。
[0014] 本發明所述的偶聯反應，其反應物的摩爾比為氨基樹脂：Fmoc-氨基酸或片段=1 : 1. 5-5,優選為 1 :3。
[0015] 本發明所述的保護氨基酸或片段的活化反應，其反應物的摩爾比為Fmoc-氨基酸 或片段：DIC:H0Bt=l:1. 05-1. 3 :1. 1 ~1. 5,優選為 1 :1. 05 :1. 2。反應時間為 0. 25-2 小時， 優選為0. 5小時。反應溶劑為DMF、DCM、NMP、THF，優選為DMF。
[0016] 本發明所述的偶聯反應，其偶聯反應時間為1~8小時，優選為2~3小時。
[0017] 本發明所述的偶聯反應，脫除保護基團Fmoc的試劑為10~30%PIP/DMF(體積百 分數）溶液，優選的為20%。用量為每克料樹脂5~15ml，優選為每克投料樹脂8~12ml。 去保護反應時間為10~60分鐘，優選為20~35分鐘。
[0018] 本發明所述的偶聯反應洗涂溶劑為DMF、DCM，優選為DMF。
[0019] 本發明所述的依非己特膚樹脂酸解反應具體為：依非己特膚樹脂加入酸解試劑， 室溫攬拌反應，同時脫去樹脂及側鏈保護基，過濾、濾洗，濾液和洗液合并，濃縮至少量，加 乙酸沉淀，過濾、濾洗、干燥得還原型依非己特粗品。
[0020] 還原型依非己特粗品結構為Mpr-Harg-Gly-Asp-hp-Pro-切3-畑2。
[0021] 所述依非己特樹脂酸解時采用的酸解試劑為S氣醋酸（TFA)、S異丙基硅烷 (TIS)、1，2-乙二硫醇（EDT)和水化0)混合溶液，其體積比為其體積比為TFA:TIS:EDT: &0=90-95 :1-3 :2-4 :2-4。優選的，TFA:TIS:EDT化0=95 :1 :2 :2。
[0022] 所述依非己膚特膚樹脂酸解所需酸解試劑用量為4~15ml/g膚樹脂，優選的，8~ 12ml/g膚樹脂。
[0023] 非己膚特膚樹脂酸解反應條件為室溫攬拌反應1~4小時，優選的，2小時。
[0024] 本發明所述的將還原型依非己特粗品氧化得依非己特粗品，具體為：還原型依非 己特粗品用醋酸溶解，用氧化劑氧化環化，還原型依非己特結構中Mpr中的琉基（SH)和切S 中的（SH)經氧化形成二硫鍵（S-S)而得到依非己特粗品。