一種土壤漆酶活力的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明設及±壤漆酶活力測定方法，尤其設及一種用于森林±壤漆酶活力的標準 化測定方法。
【背景技術】
[0002] 漆酶（Laccase)，屬EC1. 10. 3. 2(對苯二酪氧化酶)，其活性中屯、含多個銅原子，參 與木質（纖維）素解聚并氧化腐殖質等分子，可被酪類物質誘導合成，漆酶廣布于真菌巧曰白 腐或褐腐擔子菌、軟腐子囊菌)、細菌和古菌。多酪類聚合物是調落物分解的瓶頸，而漆酶是 將木質素氧化為酪氧自由基的關鍵酶。因此，漆酶在森林生態系統碳氮循環過程中是極為 關鍵的蛋白酶。
[0003]然而，漆酶的測定方法目前仍無令人信服的標準化流程。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種±壤漆酶活力的測定方法，該方法旨在通過一級動力學 方程，明確±壤漆酶對底物利用的最大的潛勢和產物形成的最大平均時間，并藉此計算漆 酶活力，有利于±壤漆酶活力測定方法的統一化和標準化。
[0005]本發明是通過如下技術方案實現的： 一種±壤漆酶活力的測定方法，所述方法利用一級動力學模型，確定漆酶底物利用最 大潛勢和最大產物合成的平均時間，并W此為基礎計算漆酶活力；利用酶產物合成動力學 特征參數，從而使得漆酶活力測定過程更為標準化；包括W下過程： (1)無菌生理鹽水浸提新鮮±壤樣品，水±比10:1，重量比； (2 )ABTS為底物，其工作濃度為20-30mM; (3) W96孔板為底物一酶液檢測載體，W酶標儀測定產物吸光值； (4) 于不同底物一酶反應時間測定漆酶產物的吸光值； (5) 利用非線性回歸模型，計算漆酶產物的最大合成潛勢，W及相應的平均合成時間； (6) 利用上述最大產物合成潛勢和平均合成時間，計算±壤漆酶活力。
[0006]所述的一種±壤漆酶活力的測定方法，所述MABTS底物，20-30mMABTS為最適底 物濃度，通過設立一系列底物濃度，即1，2，3，5，8，12，20，30和50mlABTS底物，明 確20-30mlABTS濃度條件下，漆酶產物的吸光值隨培養時間而持續增加，且不受±壤環境 因子的抑制。
[0007]所述的一種±壤漆酶活力的測定方法，所述測定產物吸光值，0-6小時持續測定吸 光值，由于漆酶一底物反應過程符合一級動力學特征而非直線方程，即產物合成會經歷初 始快速合成、吸光值迅速升高，而中期緩慢、后期停滯的動力學特征；因此，選取如下時間點 測定漆酶產物的光吸收值：底物一酶液混合前1小時內，5-10分鐘間隔測定產物吸光值， 中、后期20-30分鐘間隔測定吸光值。
[0008]所述的一種±壤漆酶活力的測定方法，所述方法通過一級動力學方程擬合漆酶產 物動力學過程，并將酶活力與動力學參數計算相結合，進而確定特定森林±壤條件下漆酶 對底物利用的最大活力，W及形成最大產物合成的時間尺度，從而避免傳統方法中對漆酶 酶活力測定的時間點與最大產物生成量的主觀臆斷。 具體實施方案
[0009] 下面通過實例對本發明做進一步詳細說明。
[0010] 一種修正森林±壤漆酶活力的測定方法，通過一定底物濃度梯度確定最適底物 2, 2' -聯氮雙（3-乙基苯并嚷挫嘟-6-橫酸)二錠鹽（ABTS)濃度，利用一級動力學方程模擬 ±壤漆酶活力一底物反應過程，并擬合出特定森林±壤條件下的漆酶活力潛勢W及相關過 程的速率常數，從而確定特定森林生態系統漆酶酶活力相關的動力學參數。此測定方法避 免在漆酶傳統測定過程中，因±壤復雜環境因素引起的漆酶活力抑制、初始濃度變化時間 難于把握W及最大產物生成量無法計算等原因造成的漆酶活力測定和計算的不準確和不 可靠。
[0011] 實施例1 1、稱2g(干重）鮮±(<2mm)，溶于20血滅菌的0. 9%化C1 (體積準確）。30DC，170rpm，l小時。濾紙過濾，取一半濾液，于沸水中煮沸30分鐘，陰性對照。所有濾液于4 "C備 用。
[001引 2、200 y 1反應體系，依次于96孔板上加入：雜100 jiL抑5. 0巧樣酸鹽一憐酸鹽 緩沖液；?孟.50化±壤浸提液；鬚：50化SOmMABTS江作濃度20mlABTS)。
[0013] 3、96孔板樣品排列與說明： 96孔板樣品排列
4、檢測條件：96孔板培養溫度為30°C;波長為420nm;吸光值讀取時間為酶液培養前 1小時內，隔5分鐘讀取吸光值1次，之后的5個小時內每隔半小時讀取吸光值1次；檢測 總時長為8小時；利用多功能酶標儀進行光吸收值檢測。
[0014] 5、最大產物生成潛勢計算：漆酶產物合成符合一級動力學方程，即ODt= 0Dm3xX
[l-exp(-kXt)]，其中，ODt為時間t時的酶產物吸光值，ODM。,為生成產物最大理論吸光值，t為酶一底物培養時間，k為產物生成速率常數，1/k即為得到的平均反應時間MPT。將不同 培養時間（t)和相應吸光值（ODt)代入非線性方程，并擬合出ODm。、。
[001引 6、酶活力計算：酶活力扣/L) =a(T6/U20)X(V總/V酶）X(ODwax/MPT)。運 里的酶活定義為：25°C，每分鐘內，氧化1ymol的ABTS所需酶量。公式解釋：V,自和V酶代 表反應體系的總體積和經過適當稀釋后的反應酶液體積，ODm。、代表在MPT時間內吸光值的 變化。ABTS的摩爾消光系數（molarextinctioncoefficient)C42。數值取 36, 000mol L1cm1。
[0016] 7、最后，樣品漆酶活力應扣除陰性(滅菌±)對照。
[0017] 實施例2 1、稱5g(干重)鮮±(<2mm)，溶于50血滅菌的0. 9%化C1 (體積準確）。30DC，170rpm，l小時。濾紙過濾，取一半濾液，于沸水中煮沸45分鐘，陰性對照。所有濾液于4 "C備 用。
[001引 2、200y1反應體系，依次于96孔板上加入：雜100jiL抑5. 0巧樣酸鹽一憐酸鹽 緩沖液；?孟.50化上壤浸提液；鬚：50化IWrnMABTS(工作濃度30mlABTS)。
[0019] 3、96孔板樣品排列與說明： 96孔板樣品排列
4、檢測條件：96孔板培養溫度為30°C;波長為420nm;吸光值讀取時間為酶液培養前 1小時內，隔5分鐘讀取吸光值1次，之后的5個小時內每隔半小時讀取吸光值1次；檢測 總時長為8小時；利用多功能酶標儀進行光吸收值檢測。
[0020] 5、最大產物生成潛勢計算：漆酶產物合成符合一級動力學方程，即ODt=ODmaxX [l-exp(-kXt)]，其中，ODt為時間t時的酶產物吸光值，ODM。,為生成產物最大理論吸光值， t為酶一底物培養時間，k為產物生成速率常數，1/k即為得到的平均反應時間MPT。將不同 培養時間（t)和相應吸光值（ODt)代入非線性方程，并擬合出ODm。、。
[0021] 6、酶活力計算：酶活力扣/1>(10~6/U20)X(V.営/V酶）X(ODwax/MPT)。運里 的酶活定義為：25°C，每分鐘內，氧化1ymol的ABTS所需酶量。公式解釋：V,自和Vg*代表 反應體系的總體積和經過適當稀釋后的反應酶液體積，ODm。、代表在MPT時間內吸光值的變 化。ABTS的摩爾消光系數（molarextinctioncoefficient)C42。數值取 36, 000moll1 cm1。
[0022] 7、最后，樣品漆酶活力應扣除陰性(滅菌±)對照。
【主權項】
1. 一種土壤漆酶活力的測定方法，其特征在于，所述方法利用一級動力學模型，確定漆 酶底物利用最大潛勢和最大產物合成的平均時間，并以此為基礎計算漆酶活力；利用酶產 物合成動力學特征參數，從而使得漆酶活力測定過程更為標準化；包括以下過程： (1)無菌生理鹽水浸提新鮮土壤樣品，水土比10:1，重量比； (2 )ABTS為底物，其工作濃度為20-30mM; (3) 以96孔板為底物一酶液檢測載體，以酶標儀測定產物吸光值； (4) 于不同底物一酶反應時間測定漆酶產物的吸光值； (5) 利用非線性回歸模型，計算漆酶產物的最大合成潛勢，以及相應的平均合成時間； (6) 利用上述最大產物合成潛勢和平均合成時間，計算土壤漆酶活力。2. 根據權利要求1所述的一種土壤漆酶活力的測定方法，其特征在于，所述MABTS底 物，20-30mMABTS為最適底物濃度，通過設立一系列底物濃度，S卩1，2，3，5，8，12，20， 30和50mMABTS底物，明確20-30mMABTS濃度條件下，漆酶產物的吸光值隨培養時間而 持續增加，且不受土壤環境因子的抑制。3. 根據權利要求1所述的一種土壤漆酶活力的測定方法，其特征在于，所述測定產物 吸光值，0-6小時持續測定吸光值，由于漆酶一底物反應過程符合一級動力學特征而非直線 方程，即產物合成會經歷初始快速合成、吸光值迅速升高，而中期緩慢、后期停滯的動力學 特征；因此，選取如下時間點測定漆酶產物的光吸收值：底物一酶液混合前1小時內，5-10 分鐘間隔測定產物吸光值，中、后期20-30分鐘間隔測定吸光值。4. 根據權利要求1所述的一種土壤漆酶活力的測定方法，其特征在于，所述方法通過 一級動力學方程擬合漆酶產物動力學過程，并將酶活力與動力學參數計算相結合，進而確 定特定森林土壤條件下漆酶對底物利用的最大活力，以及形成最大產物合成的時間尺度， 從而避免傳統方法中對漆酶酶活力測定的時間點與最大產物生成量的主觀臆斷。
【專利摘要】一種用于測定土壤漆酶活力的方法，涉及土壤漆酶活力測定方法，該方法包括如下步驟：1、利用滅菌的0.9%？NaCl浸提新鮮土樣；2、于96微孔板上，以2,2ˊ-聯氮雙二銨鹽（ABTS）為底物，底物工作濃度為20-30mM；3、吸光值測定時間，每5-10分鐘測定吸光值1次，1-5小時時間段，20-30分鐘測定吸光值1次；4、利用一級動力學方程，擬合漆酶產物生成過程，并確定漆酶產物最大生成量時吸光值，以及生成相應的最大產物量的平均合成時間；5、計算漆酶活力。此法排除傳統線性方程計算漆酶活力時，初始濃度時間段選取時的主觀臆測，以及最大產物生成量難以確定的不足。本發明有利于土壤漆酶活力測定方法的統一和標準化。
【IPC分類】C12Q1/26
【公開號】CN105200118
【申請號】CN201510614584
【發明人】蘇寶玲, 王月陽, 白震, 范業展, 唐強
【申請人】沈陽大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月24日