一種快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種復合微生物菌劑的檢測方法，具體設及一種快速測定復合微生物 菌劑中多粘類芽抱桿菌含量的方法，屬于微生物檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 微生物肥料俗稱細菌劑料，簡稱菌劑，是指一類含有活微生物的特定肥料，應用于 農業生產中，能夠獲得特定的肥料效應。施用后通過菌劑中微生物的生命活動，借助其代謝 過程或代謝產物，W改善植物生長條件，尤其是營養環境。為了提高肥效，常在菌劑中混合 幾種活微生物。
[0003]多粘類芽抱桿菌、枯草芽抱桿菌及膠凍芽抱桿菌等微生物不僅具有農藥的殺菌作 用，而且還能改善±壤環境，促進植物生長，具有肥料的作用。為了最大限度的利用復合微 生物菌劑的功效，目前常將枯草芽抱桿菌、多粘類芽抱桿菌及膠凍芽抱桿菌混合制成復合 菌劑。膠凍樣芽胞桿菌，又稱娃酸鹽細菌，盡管其對營養條件要求不高，對環境條件適應性 強，但通常情況下，添加在復合菌劑中的膠凍樣芽抱桿菌的量只有枯草芽抱桿菌或多粘類 芽抱桿菌量幾十分之一甚至百分之一，因此，將復合菌劑稀釋到相應倍數測定枯草芽抱桿 菌和多粘類芽抱桿菌含量時，即便膠凍樣芽抱桿菌能在該培養條件下生長，但其生長的菌 量對枯草芽抱桿菌和多粘類芽抱桿菌統計結果也不會造成顯著性影響，故此測定時，常不 考慮膠凍樣芽抱桿菌的量；同時膠凍樣芽抱桿菌的測定相對較容易，由于其在選擇性（無 氮或無有效憐鐘養分）固體培養基上有其獨特菌落和細胞形態特征，因而不需生化特性檢 測或基因序列分析也很容易與其他細菌區分。但枯草芽抱桿菌與多粘類芽抱桿菌所使用的 培養基相同，在常規的培養條件下，枯草芽抱桿菌生長速度較快，而多粘類芽抱桿菌生長速 度相對較慢，培養基中快速長出的枯草芽抱桿菌覆蓋了多粘類芽抱桿菌，從而使得無法準 確統計多粘類芽抱桿菌的含量，而且枯草芽抱桿菌的適應性較多粘類芽抱桿菌更強，通過 控制培養溫度等簡單方法難W準確統計多粘類芽抱桿菌的含量。隨著近年來此類菌劑的生 產和應用越來越廣泛，我們急需建立一種簡易、快速、能準確測定多粘類芽抱桿菌含量的方 法。
[0004]氨節西林鋼（AmpicillinSodium,CAS號：69-52-3)。化學結構式： 陽0化]
[0006]化學式而化8噸化〇45。氨節西林鋼屬于青霉素類抗生素，可W用于肌內注射或者 靜脈注射，主要用W治療敏感細菌所致的上、下呼吸道感染、胃腸道感染、尿路感染、皮膚、 軟組織感染、腦膜炎、敗血癥、屯、內膜炎等。目前還沒有氨節西林鋼抑制枯草芽抱桿菌或多 粘類芽抱桿菌的文獻報導。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供一種快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽抱桿菌含量的方 法，W簡化操作，獲得更為準確的檢測結果。為達到上述發明目的，本發明采用了W下技術 方案：
[0008] 一種快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽抱桿菌含量的方法，所述復合微生物 菌劑的活性成分為枯草芽抱桿菌、多粘類芽抱桿菌和膠凍樣芽抱桿菌，該方法包括W下步 驟：
[0009] 1)在微生物培養基中加入氨節西林鋼，使其濃度達到0. 05~0. 3 y g/mU混勻后 制成平板；
[0010] 2)將待測復合微生物菌劑在含重量百分比為0. 05~0. 5%Tween-80的生理鹽水 中溶解后，置于磁力攬拌器上，在室溫下攬拌20~40min，轉速為100~20化pm，然后再將 該溶液置于超聲水浴鍋中，超聲20~40min，制得待測樣品溶液；
[0011] 3)將待測樣品溶液均勻涂布在步驟（1)制得的平板上，涂布完成后，將其放入 32°C恒溫培養箱中，24~4化后統計各平板菌落數并計算含量。 陽〇1引優選地，所述氨節西林鋼的濃度為0.1yg/mL。
[0013] 所述微生物培養基為PDA培養基。
[0014] 優選地，步驟。中，將待測復合微生物菌劑在含重量百分比為0.1 %Tween-80的 生理鹽水中溶解后，置于磁力攬拌器上，在室溫下攬拌30min，轉速為15化pm，然后再將該 溶液置于超聲水浴鍋中，超聲30min，制得待測樣品溶液。
[0015] 本發明的有益效果是：
[0016] 本發明通過向培養基中加入一定濃度的氨節西林鋼，抑制枯草芽抱桿菌的生長， 但不抑制多粘類芽抱桿菌的生長，從而避免了快速長出的枯草芽抱桿菌對多粘類芽抱桿菌 統計數據的影響。該方法通過計數菌落的數量并換算成活芽抱含量，可W快速、簡便、準確 地測定復合微生物菌劑中多粘類芽抱桿菌的含量。
【附圖說明】
[0017] 圖1是本發明實施例中測定方法流程圖。
[0018] 圖2是不同濃度氨節西林鋼對枯草芽抱桿菌和多粘類芽抱桿菌的抑菌圈試驗化1 為枯草芽抱桿菌、K3為多粘類芽抱桿菌）。
[0019] 圖3是多粘類芽抱桿菌在含不同濃度氨節西林鋼平板上生長情況照片。
[0020]圖4是枯草芽抱桿菌、多粘類芽抱桿菌和膠凍樣芽抱桿菌的混合菌在含不同濃度 氨節西林鋼平板上生長情況照片。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合附圖及實施例對本發明作進一步詳細描述：
[0022] 實施例：采用圖1所示方法流程，分別對枯草芽抱桿菌顆粒菌劑、多粘類芽抱桿菌 液體菌劑、枯草芽抱桿菌+多粘類芽抱桿菌+膠凍樣芽抱桿菌復合顆粒菌劑、枯草芽抱桿菌 +多粘類芽抱桿菌+膠凍樣芽抱桿菌復合液體菌劑的含量進行測定，依次作為實施例1~ 4。
[0023] 測定步驟如下：
[0024] 1)取PDA培養基，裝入500血的立角瓶內，高壓蒸汽滅菌后，待冷卻至55~65°C 后加入氨節西林鋼，使其濃度分別達到0. 1yg/mL、0. 2yg/mL、0. 3yg/mL、0. 4yg/mL、 0. 5yg/mU混勻后制成PDA平板。
[00巧]。在無菌操作條件下，將樣品攬拌均勻，準確稱取10.0 g樣品，加入90血含0.1% (重量百分比）Tween-80的的滅菌生理鹽水中，充分溶解后，置于磁力攬拌器上攬拌30min， 然后再將該溶液置于超聲水浴鍋中，超聲30min，得到稀釋10倍的樣品溶液，標記為0號，然 后依次進行10倍梯度稀釋，每個稀釋度設3個重復樣品。
[00%] 3)將上述各梯度稀釋液分別吸取100y以用L形玻棒均勻涂布在步驟（1)所得平 板上，32°C恒溫培養箱中2地，選擇適宜的稀釋度，菌落數在30~300的平板為有效計數平 板。
[0027] 4)計算加入不同濃度氨節西林鋼后的活芽抱含量為N=一xtxlQ,式中N是活芽 m 抱數，單位為C化/g;c是同一稀釋倍數的多個有效計數平板上的平均菌落數；m是稱取的菌 劑樣品質量，單位為g;t是統計平板對應的稀釋倍數。 陽0測結果比較：
[0029] 將0yg/mL含量的氨節西林鋼PDA平板作為各實施例的對照組，對各實施例中含 不同濃度氨節西林鋼的PDA平板的測定結果進行比較，結果如表1所示。
[0030] 從表1可W看出，實施例1義用本發明的方法，在含較低濃度氨節西林鋼的PDA 平板上未能檢測出活芽抱，說明氨節西林鋼對枯草芽抱桿菌有很好的抑制作用。運一結論 我們從圖2所示的抑菌圈試驗中也能看出：即在含0. 1yg/血氨節西林鋼的平板上，K1所 表示的枯草芽抱桿菌都有抑菌圈出現，而K3所表示的多粘類芽抱桿菌則在較低氨節西林 鋼濃度下沒有抑菌圈出現或是抑菌圈不明顯，只有在較高濃度下，才出現了明顯的抑菌圈； 實施例2采用本發明的方法均能檢測出活芽抱，但隨著氨節西林鋼含量的增大，活芽抱數 有所減少，說明選擇適當含量的氨節西林鋼對本發明的檢測結果至關重要。運一結論在 圖3中也能看出：即在圖示的3個氨節西林鋼濃度梯度下，都有多粘類芽抱桿菌的生長，且 0. 1 y g/mL-0. 2 y g/mL濃度下，其生長菌量與空白對照平板上生長的菌量幾乎沒有差異，當 濃度升到0. 5 y g/mL時，多粘類芽抱桿菌生長的量出現了明顯減少；實施例3和實施例4測 定結果顯示：在含低濃度氨節西林鋼的PDA平板上，檢測出的活芽抱數與添加在復合菌劑 中的多粘類芽抱桿菌含量相當，而在不含氨節西林鋼的對照組PDA平板上，檢測出的活芽 抱數與添加在復合菌劑中的枯草芽抱桿菌含量相當，運說明適當含量的氨節西林鋼同樣對 復合微生物菌劑中的枯草芽抱桿菌有抑制作用，而對多粘類芽抱桿菌沒有影響。同樣，運一 結論在圖4中也能看出：即復合菌劑在不加氨節西林鋼的平板上生長的菌的菌落形態及菌 量都與枯草芽抱桿菌一樣，而在含不同濃度氨節西林鋼的平板上生長的菌的菌落形態與不 加氨節西林鋼的平板上生長的菌的菌落形態則完全不同，再結合生長的菌量，不難看出該 菌應為多粘類芽抱桿菌。
[0031]綜合表1及圖2-4的結果，采用本發明的方法測定復合微生物菌劑中多粘類芽抱 桿菌含量不僅操作簡單，而且快速、準確，是一個較理想的檢測方法。
【主權項】
1. 一種快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌含量的方法，所述復合微生物菌劑 的活性成分為枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，其特征在于包括以下步 驟： 1) 在微生物培養基中加入氨芐西林鈉，使其濃度達到0. 05~0. 3yg/mL，混勻后制成 平板； 2) 將待測復合微生物菌劑在含重量百分比為0. 05~0. 5%Tween-80的生理鹽水中溶 解后，置于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌20~40min，轉速為100~200rpm，然后再將該溶 液置于超聲水浴鍋中，超聲20~40min，制得待測樣品溶液； 3) 將待測樣品溶液均勻涂布在步驟（1)制得的平板上，涂布完成后，將其放入32°C恒 溫培養箱中，24~48h后統計各平板菌落數并計算含量。2. 如權利要求1所述快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌含量的方法，其特征 在于：步驟1)中，在微生物培養基中加入氨芐西林鈉，使其濃度達到0.Iyg/mL，混勻后制 成平板。3. 如權利要求1所述快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌含量的方法，其特征 在于：所述微生物培養基為PDA培養基。4. 如權利要求1所述快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌含量的方法，其特征 在于：步驟2)中，將待測復合微生物菌劑在含重量百分比為0. 1%Tween-80的生理鹽水中 溶解后，置于磁力攪拌器上，在室溫下攪拌30min，轉速為150rpm，然后再將該溶液置于超 聲水浴鍋中，超聲30min，制得待測樣品溶液。
【專利摘要】本發明公開了一種快速測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌含量的方法，所述復合微生物菌劑的活性成分為枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌和膠凍樣芽孢桿菌，本發明通過向培養基中加入一定濃度的氨芐西林鈉，抑制枯草芽孢桿菌的生長，但不抑制多粘類芽孢桿菌的生長，從而避免了快速長出的枯草芽孢桿菌對多粘類芽孢桿菌統計數據的影響。該方法可以快速、簡便、準確地測定復合微生物菌劑中多粘類芽孢桿菌的含量。
【IPC分類】C12R1/12, C12Q1/06
【公開號】CN105200116
【申請號】CN201510622375
【發明人】潘渝, 周莉, 袁善奎, 萬俊, 馬朋, 鄒維, 唐緯坤, 劉荷梅, 胡承勇, 孫剛忠
【申請人】武漢科諾生物科技股份有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月25日