天然植物皂苷功效組分的篩選方法及用圖
【技術領域】
[0001]本發明的天然植物皂苷功效組分的篩選方法及用途，屬于動物營養與飼料科學領域。該發明可作為動物營養及飼料科學研究的一種輔助方法，有利于縮短中樞調控用天然植物皂苷類用于飼料添加劑的研究周期。
【背景技術】
[0002]動物生長是一個復雜的生物代謝過程，受基因型、激素、營養、環境等多方面的影響。這些因素對生長的影響作用都是通過直接或間接影響動物內分泌系統來實現的。人和動物的生長是由促生長激素軸來調控的，促生長激素軸由生長激素釋放因子(GRF)、生長激素(GH)和胰島素樣生長因子(IGF)構成。目前的研究表明，參與豬的生長中樞調控的非營養性飼料添加劑的種類很多，如銅、半胱胺(CS87)、苯二氮卓類化合物(F89)、腎上腺素能受體激動劑(如鹽酸特倫克羅)、萊克多巴、大豆黃酮等。而由于食用安全的原因，苯二氮卓類化合物(F89)、鹽酸特倫克羅(瘦肉精)、萊克多巴等藥物被禁止用于豬等動物生長的調控。已發現植物黃酮、皂甙等對動物的生長有調節作用。因此進一步篩選參與動物中樞調控的天然活性成分具有重要的現實意義。
[0003]—些天然植物中含有皂苷、多糖、黃酮等多種藥理成分，與動物的的中樞神經的興奮和抑制過程均有影響。如五加科植物多有改善大腦的興奮過程，也增加大腦皮層的內抑制過程。1984年，Barenboim等首次從刺五加的根中提取出來刺五加苷B和E，隨后Takasugi等證明了刺五加皂苷B和E是刺五加的主要活性成分，目前已知刺五加苷B有抗疲勞作用，刺五加苷E有抗壓作用。
[0004]許多大分子物質會受到血腦屏障制約而不能進入腦內，血腦屏障可以防止血液中的神經毒素傷害中樞神經系統，具有保護性作用；對于很多必須的水溶性物質和神經組織所需的代謝物具有比較低的被動滲透性，從而保持腦組織內環境的基本穩定，對維持中樞神經系統正常生理狀態具有重要的生物學意義。
[0005]以往對于天然植物功效成分的作用及其飼料化另的研究，多是總結飼養試驗等研究成果，如:申請號為“201310296894”的專利“一種促進豬生長及改善肉質的中藥飼料添加劑”、申請號為“201310609512”的專利“一種促進豬生長的綠色飼料預混料”、申請號為“201310002811”的專利“一種可促進豬生長及降低豬肉膽固醇的復合飼料添加劑”等，這樣使研究的周期變長及其對調控機理的認識受到限制。通過血腦屏障模型篩選參與動物中樞調控的天然活性成分是較快捷徑的方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是建立一種天然植物中對中樞調控發揮作用的皂苷組分篩選方法，縮短天然植物皂苷用于動物生長促進劑的研究周期。
[0007]天然植物皂苷功效組分的篩選方法，按照下述步驟進行:(I)將已經分離純化的豬腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞共培養建立豬的離體血腦屏障模型，以細胞培養板為介質，將內皮細胞和星形膠質細胞共培養，然后通過滲漏試驗來初步判斷模型的完整性。通過實時監測共培養模型的跨膜電阻值，來進一步確定模型的完整性。最后通過蘆丁通透性測試和熒光素鈉通透系數測定來評價共培養模型的功能。借助此模型研究刺五加皂苷B和E在血腦屏障模型的通透性。
[0008]天然植物皂苷功效組分的篩選方法的用途，用于篩選天然植物中對中樞調控發揮作用的皂苷組分。
[0009]本發明的優點
[0010]1、建立了一種簡便的篩選動物中樞調控的非營養性生長促進劑的方法
[0011]2、降低了實驗的成本和可操作性的難度
[0012]3、極大地縮短了研究的周期
【附圖說明】
[0013]圖1為星形膠質細胞和微血管內皮細胞共培養示意圖，
[0014]圖2為刺五加皂苷B在體外BBB模型中不同時間點的通透率。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
[0016]1.離體血腦屏障共培養模型的建立用.25%胰酶將符合試驗要求的豬星形膠質細胞消化下來，然后離心，留底部沉淀，用培養用完全培養基重懸底部沉淀，調整細胞密度，以4X 15接種于處理過的Transwell培養板的底部，然后將其倒置于無菌燒杯中，培養箱中培養3小時，然后取出按正常位置放置于24空培養版中，培養小室和培養池中均加入足量的培養液，培養箱中正常培養，一周后，接種豬腦微血管內皮細胞。
[0017]將消化下來的純化的腦微血管內皮細胞以5X 15密度接種于涂布有鼠尾膠的Transwell培養板的上面，在供池內加入完全培養基，然后每隔兩天換液一次。直至到達試驗所需狀態為止。同時設立對照組，只接種腦微血管內皮細胞組、只接種星形膠質細胞組和空白組。
[0018]2.以刺五加為例檢測模型對不同皂苷組分的通透性:
[0019]將上述構建好的體外血腦屏障模型進行挑選，試漏試驗顯示陽性的用來進行通透性試驗。向供池中加入刺五加皂苷B和刺五加皂苷E各1ml，每種試劑分為五個濃度梯度，分別為20、30、40、50、60、70mg/L。受體池中分別加入2ml的培養基，然后在第4、8、12、16、20、24、28h時候分別從受體池中吸取200ul濾液，4°C保存備用，待所有樣品收集完畢進行分析處理。向濾液中分別加2倍體積的甲醇，超聲處理20min,后離心1min (5000r, 4°C )，取上清液，做LC/MS分析。結果表明:大量的刺五加皂苷B通過體外血腦屏障模型，24h通透率為(58.24±1.32) %，刺五加皂苷E在濾液中未檢測到。
【主權項】
1.天然植物皂苷功效組分的篩選方法，按照下述步驟進行:(I)將已經分離純化的豬腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞共培養建立豬的離體血腦屏障模型，以細胞培養板為介質，將內皮細胞和星形膠質細胞共培養，然后通過滲漏試驗來初步判斷模型的完整性。通過實時監測共培養模型的跨膜電阻值，來進一步確定模型的完整性。最后通過蘆丁通透性測試和熒光素鈉通透系數測定來評價共培養模型的功能。借助此模型研究刺五加皂苷B和E在血腦屏障模型的通透性。2.天然植物皂苷功效組分的篩選方法的用途，用于篩選天然植物中對中樞調控發揮作用的皂苷組分。
【專利摘要】本發明公開了天然植物皂苷功效組分的篩選方法及用途，屬于動物營養與飼料科學領域。采用離體血腦屏障模型，通過模型的通透性試驗篩選進入中樞的天然植物皂苷的功效組份，作為動物營養及飼料科學研究的一種輔助方法，有利于縮短中樞調控用天然植物皂苷類用于飼料添加劑的研究周期。
【IPC分類】C12Q1/02
【公開號】CN105200111
【申請號】CN201510561547
【發明人】楊連玉, 車東升, 楊文艷, 孔志偉, 董曉慶, 王軍, 張天芮, 趙春雨
【申請人】吉林農業大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年8月31日