鑒別魚腥草與百部還魂的分子特異性標記引物及方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種鑒別魚腥草（化ut化yniacordata化unb)和百部還魂 (GymnothecachinensisDecne)的分子特異性標記引物，W及一種利用該特異性引物對魚 腥草和百部還魂的快速鑒別的方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 中藥魚腥草為S白草科植物蔑菜（質化阿iacor泌紅巧的新鮮全草或干 燥地上部分。中藥百部還魂為同科植物裸葫（場皿cAineasis化>cne)的全草或葉。 兩者功效和主治均不相同，但由于分布相同，常混生，形態相似，因此極易誤采誤用；是常見 的魚腥草混淆品，應嚴格區別。魚腥草與運些常見混淆品的鑒別可從原植物的葉的形態與 顯微特征等傳統手段進行一定程度的鑒定。但是一旦干燥或經過加工，用運些傳統方法進 行準確鑒別存在一定難度。而利用化學成分的分析進行鑒定，只根據特定化學成分很容易 被誤導，也難判斷是否混雜。因此急需魚腥草與其常見混淆品相關產品的快速鑒定方法。 由于葉綠體dm較核基因組DNA具有更高的拷貝數，在植物相關產品中更為穩定，本研究 擬全面分析來源于不同居群的魚腥草與其常見混淆品植物葉綠體DNAtmkF區的SNP位 點，獲得相互鑒別穩定的SNP位點，基于運些位點設計引物，建立多重PCR體系，建立快速、 有效、穩定鑒定魚腥草與其常見混淆品植物及其相關加工產品，并確定他們是否相互混雜 的方法，W監控運些產品的質量。
[0003] 隨著分子生物學的發展，多種DNA分子標記技術，而植物葉綠體tmkF基因具 有大量拷貝數，因此被廣泛用于植物產品的檢測，本文擬對魚腥草和百部還魂tmkF 區序列進行測定，分析其序列結構和特征，尋找單核巧酸多態性（singlenucleotide polymo巧hismSN巧分子標記，設計分別識別魚腥草和百部還魂的特異識別引物，建立多重 PCR技術，可快速簡單鑒別魚腥草和百部還魂的方法。本發明為魚腥草和百部還魂的分子輔 助鑒別提供了可能性，對有效的鑒別和保護2種中藥種質資源具有非常重要的意義，檢索 未見魚腥草和百部還魂的分子鑒定的發明專利申請。
【發明內容】
[0004] 本發明的主要目的是提供一種可準確，快速，簡單鑒定魚腥草和百部還魂的技術， 為準確用藥提供技術支持。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 分別設計特異識別的魚腥草的上游特異性引物化F(5, -TTTTCTTCGTCATTGATTCC-3')、和特異識別百部還魂的上游特異性引物GcF(5'-AGGAAGAAGCGAATATTCCG- 3')分別 與下游引物付化-化（5' -TCCTCTGCTCTACCAGCTGAG- 3'）構建多重PCR體系：總量為20 yL從植物中提取1 0ng的DNA作為擴增模版，加入liiLIXTransStartTophqDNA聚 合酶（TransGen公司），2]iLlOXTransStartTopl'aqBuffer,dNTP2. 5mM, 0. 2]iM下游 引物tmL-化和上游的2個特定的引物化F、GcF各0. 1iiM，其余為無菌水。構建多重PCR 體系，反應程序如下：95°C預變性2分鐘，95°C變性30s，50°C引物退火30s和72°C延 伸2分鐘，35個循環；最后一個循環在72°C延伸7分鐘，W確保完整的延伸PCR產物。只 有魚腥草取得了 43化P，而百部還魂生成特定的67化P的條帶。
[0006] 本發明的優點在于： 由于僅根據某些特征活性化學成分的存在進行鑒別，易受植物成長環境等外在條件的 影響，很難進行準確鑒別，特別是混合樣品的鑒別。本方法基于遺傳背景的進行分子鑒定， 不受藥材的產地等外在因素的影響，相對于化學方法，更為準確，也更為簡單方便。
[0007] 由于葉綠體DNA比基因組DNA的拷貝數更多，在干燥及加工后的產品中更為穩定， 本方法利用葉綠體DNA作為檢測對象，比利用基因組DNA作為檢測對象，更適合用于對在干 燥及加工后的產品的鑒定。
【附圖說明】
[0008] 圖1利用引物tmkFr，化F，GcF多重PCR的產物凝膠電泳（M: 2logDNA ladder;1-5 :百部還魂；69-11 :魚腥草；）。
【具體實施方式】
[0009] 實施例1 1儀器 PCR儀巧ppendo計，型號5332)，電泳系統（北京市六一儀器廠，型號DYY-12)，低溫 冷凍離屯、機巧ppendo計，型號5810R)，凝膠成像分析儀度I0-RAD化emiDocXRS)，微量移 液器巧卵endo計）。
[0010] 2 試劑 2XCTAB提取液，1XTAE緩沖液，瓊脂糖（Promega公司），漠化乙錠（Fluka公 司），TransSta;rt?Topl'aqDNAPolymerase(北京全式金公司），S氯甲燒、無水乙醇、 異丙醇均為國產分析純。
[0011] 3 材料 本研究實驗樣品是收集的采自不同產地的樣品并經鑒定確認是魚腥草（化uttuynia cordataThunb)和百部還魂（GymnothecachinensisDecne)。
[001引 4方法DM提取： 山取5g新鮮魚腥草和百部還魂植物葉片剪碎，置于經過殺菌的研鉢中，加入0.5 評VP粉末，再加入液氮迅速研磨，將粉末收集于袋子中，置于-20 °C保存，長時間保存則置 于-80 °C中； 似取10血CTAB溶液于65 °C水中預熱，再加0. 2血(200yL)琉基乙醇于預熱的CTAB中場寧L基乙醇：CTAB溶液=1:50); 樹取步驟（1)獲得的粉末0.2g于2mLEP管(離屯、管)，迅速加入1mL預熱的含有琉 基乙醇的CTAB溶液(樣品低溫時加入)，振蕩2分鐘左右將其放入65 °C水浴鍋，水浴約1小 時；(每20分鐘振蕩一次，可適當多振蕩幾次）； (4)往管中加入600yL氯仿-異戊醇混合液(氯仿：異戊醇體積比=24:1，必須在通風 楓操作)，搖勻5分鐘，再將其置于15-20°CW1200化pm離屯、10分鐘； 腳取600yL上清液，再加入1. 2血（2倍）預冷的無水乙醇或360yL(0. 6倍）異丙 醇，置于-20 °C沉淀約3小時或過夜； 做取出EP管于4°C條件下W12000rmp離屯、10分鐘，去掉上清液，倒置于吸水紙數 分鐘； 仍再加入700yL70%乙醇，上下顛倒數次，洗涂沉淀，后于4 °C條件下W12000rmp離屯、10分鐘，去掉上清液，再重復一遍，最后置于超凈臺中吹干；（注意：不可吹干過度） 佩在EP管中加入30-50化去離子水（d地20)或1XTE溶液，于4 °C放置3小時或 過夜，使其充分溶解，若手搖難W溶解，可用混勻機進行混勻，促其溶解； (9)可用瓊脂糖凝膠檢測其是否含基因組DNA，后進行純化。
[0013] 特異性引物設計： 根據前期測序實驗所得的魚腥草和百部還魂的tmkF基因序列，分析其特異SNP位 點，采用primerpremier5. 0軟件設計，根據引物設計的原則，通過特異性位點設計魚腥草 和百部還魂相互鑒別的特異性引物。選定魚腥草的SNPs位點設計草珊瑚特異性引物并命 名為化F。選定百部還魂特有的SNPs位點設計百部還魂特異性引物和并命名為GcF。引物 的方向與特異性見表1。
[0014] 表1引物
建立多重PCR鑒定體系 首先利用魚腥草和百部還魂的特異性引物化F、GcF分別與通用引物tmL-化構建PCR體系：總量為20yL從植物中提取1 0ng的DNA作為擴增模版，加入liiLIXTransStart TopTaqDM聚合酶（TransGen公司），2]iLlOXTransStartTopTaqBuffer,dNTP 2. 5mM，0. 2iiM下游引物tmk化和上游的2個特定的引物化F、GcF各0. 1yM，其余為無 菌水。構建多重PCR體系，反應程序如下：95°C預變性2分鐘，95°C變性30s，50°C引物 退火30s和72°C延伸2分鐘，35個循環；最后一個循環在72°C延伸7分鐘，W確保完整 的延伸PCR產物。只有魚腥草取得了 43化P，而只有百部還魂生成特定的67化P的條帶，可 見該方法能夠特異性鑒別魚腥草與百部還魂。因此，運個方法準確且節省時間，可用于許多 商業醫藥產品的測試。運是第一次運用分子技術識別魚腥草和百部還魂的混淆品及其混合 廣品。
[0015] W上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1. 鑒別魚腥草與百部還魂的分子特異性標記引物，其特征在于：所述引物為：特異識 別的魚腥草的上游特異性引物HtF:5'_TTTTCTTCGTCATTGATTCC- 3'、特異識別百部還魂的 上游特異性引物GcF:5' -AGGAAGAAGCGAATAITCCG- 3'，以及下游通用引物trnL-Fr:5' -TCCTCTGCTCTACCAGCTGAG- 3'。2. 利用權利要求1所述引物鑒別魚腥草與百部還魂的PCR方法，其特征在于：利用所 述引物構建多重PCR體系：總量為20yL，從植物中提取10ng的DNA作為擴增模版，加 入IyLIXTransStartTopTaqDNA聚合酶，2yLIOXTransStartTopTaqBuffer，dNTP 2. 5mM，0. 2yM下游引物trnL-Fr和上游的2個特定的引物HtF、GcF各0.IyM，其余為無 菌水。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：構建多重PCR體系，反應程序如下：95°C 預變性2分鐘，95°C變性30s，50°C引物退火30s和72°C延伸2分鐘，35個循環；最后一 個循環在72 °C延伸7分鐘，以確保完整的延伸PCR產物。
【專利摘要】本發明涉及鑒別魚腥草與百部還魂的分子特異性標記引物及方法，屬于生物技術領域。所述引物為：特異識別的魚腥草的上游特異性引物HtF：5’-TTTTCTTCGTCATTGATTCC-3’、特異識別百部還魂的上游特異性引物GcF：5’-AGGAAGAAGCGAATATTCCG-3’，以及下游通用引物trnL-Fr：5’-TCCTCTGCTCTACCAGCTGAG-3’。本方法基于遺傳背景的進行分子鑒定，不受藥材的產地等外在因素的影響，相對于化學方法，更為準確，也更為簡單方便。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105200050
【申請號】CN201510698574
【發明人】陳瑩, 閆淑君, 鄧傳遠
【申請人】福建農林大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年10月26日