一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物及其篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種貝類線粒體cox2 [細胞色素c氧化酶亞基II (cytochrome coxidase subunit II)]基因擴增引物的篩選方法，特別是涉及一種北方常見経類線粒體cox2基因擴增引物的篩選方法。
【背景技術】
[0002]経類隸屬軟體動物門(Mollusca)，雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，生活于潮間帶至水深400m左右的海域，其肉味鮮美，具有較高的食用價值。特別是大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶，在我國分布廣泛，是重要的經濟貝類。
[0003]近年來，由于過度采捕、海洋環境的日益惡化以及棲息地萎縮，蟶類的資源量逐年下降，急需加快對其多樣性的評估，為種質資源的合理開發利用和保護奠定基礎。線粒體脫氧核糖核酸(Mitochondrial DNA,即mtDNA)因其單親遺傳、無重組、中性進化等特性，在群體遺傳多樣性、物種鑒定、系統發生學等領域中發揮著重要作用。隨著技術和方法的不斷進步以及測序成本的減少，在過去十年里，測定的mtDNA數量明顯增長。mtDNA的獲得主要采用步移法與鳥槍法，其中步移法成本低，操作簡單，最為常用。步移法使用Long-PCR技術，Long-PCR引物的設計依賴于線粒體基因組短片段序列的獲得。得到的短片段序列越多，越有助于得到基因組全長。目前大竹蟶、長竹蟶、縊蟶的mtDNA已經測定完成，小刀蟶的mtDNA序列還未見報道。在采用步移法測定小刀経的mtDNA過程中，利用coxl基因與16S rRNA基因的短片段設計的Long-PCR引物有一對沒有擴增成功，阻礙了全長的獲得，必須得到其它的短片段序列。由于cox2基因沒有通用引物，開發適用性好的cox2基因擴增引物可加快線粒體基因組的測序進展，有助于蟶類的多樣性評估、種質資源保護與利用。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物的篩選方法，它能滿足現有技術的上述需求。
[0005]—種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物的篩選方法，其特征是a、登陸美國國立生物技術信息中心，下載大竹蟶、長竹蟶、縊蟶線粒體全序列中的cox2序列山、將下載的序列用B1Edit軟件比對分析，確定序列兩端保守區域；c、在確定的保守區域用引物設計軟件Primer Premier 5設計多對引物，送交送交有合成能力的機構合成；d、將大竹経、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個體提取DNA，然后分別和合成的多對引物在反應體系下進行PCR反應，檢測引物的擴增情況；e、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一對引物 cox2CF 和 cox2CR:cox2CF 為 5’ AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3’ ； cox2CR 為 5’GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3，。
[0006]本發明篩選出一對用于擴增北方常見蟶類線粒體部分cox2序列的引物cox2CF和cox2CR，并確定了其反應體系和PCR擴增條件，經實驗證明該引物具有條帶單一、擴增效率高的特點，有助于快速獲得線粒體基因組全長，滿足蟶類遺傳多樣性、系統發生學研究的需要。
【具體實施方式】
[0007]實施本發明的北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物的篩選方法時，分以下五步:
a、登陸美國國立生物技術信息中心(NCBI，http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),下載已有的大竹経、長竹経、溢経線粒體全序列中的cox2序列(Genbank登錄號為:HQ703012、JN786377 和 JN398366)。
[0008]b、用序列處理軟件 B1Edit (http://www.mb1.ncsu.edu/B1Edit/b1edit.html)對上述序列進行多重比對分析，確定出前后端較保守區域。
[0009]C、經比對后在前后端各100個堿基對的較保守區域內，用引物設計軟件PrimerPremier 5 (http://www.premierb1soft.com/primerdesign/index.html)設計弓丨物，設計引物時盡量避免發卡結構、引物二聚體的出現。設計的多對引物交由上海生工生物技術有限公司合成。
[0010]d、對采自山東沿海的大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個體用苯酚-氯仿法提取DNA，加雙蒸水稀釋為100 ng/μ?的工作液備用。
[0011]e、在10 μ I PCR反應體系中用合成的多對引物分別擴增這些個體的cox2片段，該體系包括:100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+plus)，0.2mM dNTPs，引物各 I μ M。PCR擴增條件為:94 °C預變性 3 min，94 °C變性 45s，46-54 °CiI火45s，72 °C延伸45s，共35個循環，最后72 °C延伸5 min。
[0012]本實驗擴增出的產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一，擴增效率高的一對引物 cox2CF (5，AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3，)和 cox2CR (5，GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3’):該引物的最佳退火溫度為50°C，產物片段長度約570bp。
【主權項】
1.一種北方常見蟶類線粒體C0X2基因擴增引物，其特征是該引物為一對，引物條帶單一、擴增效率高，分別是 cox2CF 和 cox2CR:cox2CF 為 5’ AAATTTRATTTTYTffTCATGAT 3’ ；cox2CR 為 5， GCYCCACAAATYTCAGYACACTT 3，。2.根據權利要求1所述的一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物，其特征是引物的最佳退火溫度為50°C，產物片段長度約570bp。3.權利要求1所述的一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物的篩選方法，包含以下步驟: a、下載序列:登陸美國國立生物技術信息中心，下載大竹蟶、長竹蟶、縊蟶線粒體全序列中的cox2序列； b、序列比對:將下載的序列用B1Edit軟件比對分析，確定序列兩端保守區域； C、引物設計與合成:在確定的保守區域用引物設計軟件Primer Premier 5設計多對引物，送交有合成能力的機構合成； d、DNA提取:對采集的大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個體提取DNA，加雙蒸水稀釋為.100 ng/ μ I的工作液備用； e、引物擴增:然后分別和合成的多對引物在反應體系下進行PCR反應，檢測引物的擴增情況:在10 μ I PCR反應體系中用合成的多對引物分別擴增這些個體的cox2片段，該反應體系包括 100 ng 模板 DNA，0.25 U Taq 聚合酶(Takara)，I XPCR buffer (Mg2+ plus),.0.2 mM dNTPs，引物各 I μ M ;PCR 擴增條件為:94 °C預變性 3 min，94 °C變性 45s，46-54°C退火45s，72 °C延伸45s，共35個循環，最后72 °C延伸5 min。
【專利摘要】本發明涉及一種北方常見蟶類線粒體cox2基因擴增引物及其篩選方法，分為五步：a、登陸美國國立生物技術信息中心，下載大竹蟶、長竹蟶、縊蟶線粒體全序列中的cox2序列；b、將下載的序列用軟件比對分析，確定序列兩端保守區域；c、在確定的保守區域用引物設計軟件設計多對引物，送交上海生工生物技術有限公司合成；d、將大竹蟶、長竹蟶、小刀蟶和縊蟶個體提取DNA，然后分別和合成的多對引物在反應體系下進行PCR反應，檢測引物的擴增情況；e、進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出條帶單一、擴增效率高的一對引物cox2CF和cox2CR。本發明篩選出一對引物具有條帶單一、擴增效率高的特點，有助于快速獲得線粒體基因組全長，滿足蟶類遺傳多樣性、系統發生學研究的需要。
【IPC分類】C12N15/10, C12N15/11
【公開號】CN105200046
【申請號】CN201510612109
【發明人】馮艷微, 劉相全, 韋秀梅, 姜緒, 王衛軍
【申請人】山東省海洋資源與環境研究院
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月24日