一種抗結核桿菌抗菌肽lr及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學技術領域，具體設及一種抗菌膚LR及其制備方法和應用。
【背景技術】 |；0002] 結核病（Tuberculosis)是由人類重大病原菌結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis)感染引起的，全球有立分之一的人口感染有結核桿菌，全球結核病的死 亡率在單因素的感染性疾病當中位居第二。近些年，許多可W有效控制結核病的藥物 如異煙阱、利福平、化嗦酷胺和乙胺下醇等在臨床上得到大量應用，但由于多重耐藥性 (Multi化ug-resistant，MDR)與廣泛耐藥性巧xtensively化ug-resistant，XDR)結核桿 菌菌株的大量出現，給結核病的治療帶來了嚴重困難。因此，亟待開發新型抗結核藥物來克 服結核桿菌的耐藥性問題。抗菌膚是一種生物體內合成的天然小分子多膚，是多細胞生物 天然免疫系統的重要功能分子，對細菌、真菌、病毒和原蟲等均具有直接殺滅作用。抗菌膚 具有分子量小、結構簡單、殺菌活性強、殺菌機制獨特，不易引起耐藥性等優點，被認為是極 具潛力的傳統抗生素替代藥物，具有很大的開發應用前景。
【發明內容】
[0003] 發明目的：為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種具有高效滅殺結核桿 菌的抗菌活性和極低的溶血活性的抗結核桿菌抗菌膚LR，可W有效控制結核病。
[0004] 本發明進一步要解決的技術問題在于提供上述抗結核桿菌抗菌膚LR的制備方法 和應用。 陽0化]技術方案：為實現上述技術目的，本發明提出一種抗結核桿菌抗菌膚LR，其由21 個氨基酸殘基組成，分子量2318. 65Da，凈電荷數為巧.08,等電點10. 79,其氨基酸序列如 SEQIDNO. 1 所示：Pr〇iArg2Val3lIe4Gly5T虹6Lys7ValSHis"*Glyi°ArgiiGlui2Val"T虹"GluisLeui 6Ala"ArgisAsn"Val2〇Ser2i。
[0006] 本發明進一步提出了上述抗結核桿菌抗菌膚LR在制備抗結核藥物或抗菌藥物或 保健品或化妝品中的應用。
[0007] 更進一步地，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含上述抗結核桿 菌抗菌膚LR和藥學上或美學上可接受的載體或稀釋劑。所本發明研究發現，上述抗結核桿 菌抗菌膚LR和含有LR的組合物不僅能作為抗結核病藥物，也能應用于抗菌藥物、保健品及 化妝品等領域。
[0008] 有益效果：本發明中抗結核桿菌抗菌膚LR具有分子量小、人工合成簡單、高效滅 殺結核桿菌、廣譜抗菌、溶血活性低的優點，具有廣泛的應用前景。
【附圖說明】
[0009] 圖1為化學合成LR多膚的反相高效液相色譜分析結果。
【具體實施方式】
[0010] 根據下述實施例可W更好的理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的內容僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書所詳細描述的本發 明。
[0011] 實施例1 :抗結核桿菌抗菌膚LR的制備。
[0012] (1)抗結核桿菌抗菌膚LR的化學合成方法：根據氨基酸序列，用自動多膚合成儀 (433A，AppliedBiosystems)合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。
[001引 似化學合成的LR多膚純度經過了反相高效液相色譜觸-HPLC，如圖1所示）檢 驗，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。
[0014] LR多膚氨基酸序列測定結果：
[0015] 由21個氨基酸殘基組成，分子量2318. 6抓曰，凈電荷數為巧.08,等電點10. 79其 氨基酸序列如沈QIDNO. 1 所示，具體為：Pr〇iArg2Val3IIe4Gly5!'虹6Lys7Val8His"*Glyi°ArgiiG lui2Val"T虹i4Glui5Leu"Ala"ArgisAsni9Val2〇Ser2i。
[0016] RP-HPLC(HypersilBDSC18,25*0. 46cm)分析結果顯示，LR在 46 分鐘處只出現 一個洗脫峰，而且峰型對稱性較好。
[0017] 實施例2抗結核桿菌抗菌膚LR抗菌活性檢測。
[0018] 微生物菌株接種到MH液體培養基中，37 °C振蕩培養到對數生長期，用新鮮MH液體 培養基將菌液稀釋到2Xl〇5CFU/ml備用。在無菌96孔板（Thermo,美國）各孔中預先加入 100y1MH液體培養基，然后在第一孔中加入100y1用MH液體培養基稀釋的抗菌膚LR樣 品溶液，混勻后取100y1加入第2孔，依次倍比稀釋（參見表1)，自第9孔吸出100y1棄 去，第10孔做為對照管。
[0019] 表.1稀釋方法
[0020]
[0021] 將96孔板放置37°C培養箱中緩慢振蕩培養18小時，于600nm波長處測定光吸收， 計算抗菌膚LR對不同微生物的最小抑菌濃度（MinimumInhibito巧Concentration)值。 結果如表2所示。
[0022] 抗菌膚LR的抗菌譜分析：
[0023] 同時檢測了LR對結核桿菌和其它革蘭氏陽性、陰性細菌的最小抑菌濃度（MIC)。 LR對結核桿菌的抑菌活性如表2所示，對結核桿菌標準菌株H37RV(ATCC27294)的 最小抑菌濃度為75yg/ml，對臨床分離的結核桿菌同樣有抑菌活性，最小抑菌濃度為 37.5-50yg/ml〇
[0024] 表化R對結核桿菌的抗菌活性 陽0巧]
[00%] 其中，MIC:最低抑菌濃度.運些濃度為=個獨立的實驗每個平行做兩次后得到的 平均值。CI:臨床分離菌株。
[0027]LR對其它革蘭氏陽性、陰性細菌的抑菌活性如表3所示，對革蘭氏陽性菌株 的最小抑菌濃度（MIC)都大于100yg/ml，例如對金黃色葡萄球菌標準株僅aureus ATCC2592)、金黃色葡萄球菌臨床分離株僅aureus08A865)、枯草芽抱桿菌標準株 度.subtilisATCC6633)的最小抑菌濃度（MIC)分別為 150、175、125yg/ml。LR對 革蘭氏陰性菌株的最小抑菌濃度也都大于或等于100yg/ml，例如對大腸桿菌標準株 (E.coliATCC25922)、大腸桿菌臨床分離株巧.coli08A852)、銅綠假單胞桿菌臨床分離株 (P.aeruginosa08031205)的最小抑菌濃度分別為 150、175、> 200yg/ml。
[0028] 對LR的抗菌譜分析得知，LR對結核桿菌的活性要明顯強于其他的革蘭氏陽性和 陰性細菌。
[0029] 表化R對其它革蘭氏陽性與陰性細菌的抗菌活性
[0030]
[0031] 其中，MIC:最低抑菌濃度.運些濃度為=個獨立的實驗每個平行做兩次后得到的 平均值。CI:臨床分離菌株。 陽0巧實施例3
[0033] 抗菌膚LR溶血活性測定：
[0034] 將采集的新鮮C57小鼠血與阿氏液混合抗凝，生理鹽水洗涂2次并重懸成107~ l〇Scell/ml的懸浮液。上述稀釋好的紅細胞懸液與溶解于生理鹽水的抗菌膚LR樣品混合， 37°C保溫30min，再于1000巧m離屯、5min，上清液于540皿測吸收值。陰性對照使用生理鹽 7心陽性對照使用TritonX-100,溶血百分比按W下公式計算：溶血百分比H% =A樣品-A 陰性對照/A陽性對照X100%。
[0035] 結果表明抗菌膚LR濃度為200 y g/ml時，溶血百分比為5. 07%。說明抗菌膚LR 對哺乳動物紅細胞具有極低的溶血活性。
[0036] 綜上所述，本發明中抗結核桿菌抗菌膚LR具有分子量小、人工合成簡單、高效滅 殺結核桿菌、廣譜抗菌、溶血活性低的優點，上述抗結核桿菌抗菌膚LR和含有LR的組合物 不僅能作為抗結核病藥物，也能應用于抗菌藥物、保健品及化妝品等領域。
【主權項】
1. 一種抗結核桿菌抗菌肽LR，其特征在于，所述的抗結核桿菌抗菌肽LR由21個氨基 酸殘基組成，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。2. 權利要求1所述的抗結核桿菌抗菌肽LR的制備方法，其特征在于，根據SEQIDNO. 1 所示的氨基酸序列，用自動多肽合成儀合成其全序列，通過HPLC反相柱層析脫鹽純化。3. 權利要求1所述的抗結核桿菌抗菌肽LR在制備抗結核藥物或抗菌藥物或保健品或 化妝品中的應用。4. 一種組合物，所組合物包括權利要求1所述的抗結核桿菌抗菌肽LR和藥學上或美學 上可接受的載體或稀釋劑。5. 權利要求4所述的組合物在制備抗結核藥物或抗菌藥物或保健品或化妝品中的應 用。
【專利摘要】本發明公開了一種抗結核桿菌抗菌肽LR，所述抗菌肽LR由21個氨基酸殘基組成，分子量2318.65Da，凈電荷數為+2.08，等電點10.79，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。本發明中的抗菌肽LR具有分子量小、人工合成簡單、抗菌作用廣譜高效、對結核桿菌作用效果好，溶血活性低的優點，具有廣泛的應用前景。
【IPC分類】C07K1/20, C07K14/00, A61P31/06, A61K38/16
【公開號】CN105198968
【申請號】CN201510736182
【發明人】賴仞, 莫國香, 嚴秀文, 方鳴謙
【申請人】南京農業大學
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年11月3日