一種用于治療神經膠質瘤的新二萜化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物技術領域，具體設及從白背葉的干燥葉中分離得到的一種具有治 療神經膠質瘤作用的二祗類化合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 白背葉為大戟科化地orbiaceae野桐屬植物白背葉MallotusapeltaiXour.)Muell.Arg.[RicinusapeltaLour.]的根或葉，又名酒藥子樹、白膜葉等。味微苦、澀，性 平。我國主要分布于江蘇、安徽、江西、福建、河南、廣西、海南、陜西、云南等地。白背葉在民 間應用廣泛，主要W根及葉入藥，根具有柔肝活血，健脾化濕，收斂固脫之功效，常用于慢性 肝炎，肝脾腫大，子宮脫垂，脫肛，白帶，妊娠水腫；葉能消炎止血，主要是外用，常用于中耳 炎，巧腫，跌打損傷，外傷出血。
[0003] 該屬植物含有豐富的化合物類型，主要W苯并化喃類、香豆素類、=祗類W及祗類 化合物為主。苯并化喃衍生物主要存在于白背葉的葉子中；香豆素類化合物主要存在于葉 子中，根和莖亦有分布；=祗類化合物在白背葉的根、莖、葉中均有分布。祗類化合物W二祗 類為主，存在于葉子中。此外，白背葉還含有生物堿類、黃酬類W及揮發性成分。
[0004] 研究表明白背葉葉子部分有良好的止血、抗腫瘤作用，根部分具有較好的抗病毒 和保肝活性，特別是某些化學成分具有強烈的抑制HIV、逆轉錄酶或細胞DNA聚合酶的活 性，提示其具有應用于治療乙肝和艾滋病的潛力。此外，有研究表明，白背葉根水煎劑對金 黃色葡萄球菌有抑制作用，乙醇提取物能夠抑制志賀頻疾桿菌；從根中分離出的化合物均 能在不同程度上抑制金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌及綠脈桿菌。白背葉煎劑和浸劑 能使釘螺的死亡率達到30 %~60 %。
【發明內容】
陽0化]本發明的目的是提供一種從白背葉的干燥葉中分離得到的一種具有治療神經膠 質瘤作用的二祗類化合物及其制備方法。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得W實現的：
[0007] 具有下述結構式的化合物（I)，
[0008]
[0009] 所述的化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：(a)將白背葉的干燥葉粉 碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和 水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；化）步驟 (a)中乙酸乙醋萃取物用大孔樹脂除雜，先用10%乙醇洗脫8個柱體積，再用80%乙醇洗 脫10個柱體積，收集80%乙醇洗脫液，減壓濃縮得80%乙醇洗脫物浸膏；(C)步驟化）中 80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用 體積比為20:1、12:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟（d)中組分 2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫， 收集10~12個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。
[0010] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0011] 進一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為85%。
[0012] 一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物（I)和藥學上可接受的 載體。
[0013] 所述的化合物（I)在制備治療神經膠質瘤的藥物中的應用。
[0014] 所述的藥物組合物在制備治療神經膠質瘤的藥物中的應用。
[0015] 本發明化合物用作藥物時，可W直接使用，或者W藥物組合物的形式使用。
[0016] 該藥物組合物含有治療有效量的本發明化合物（I)，其余為藥物學上可接受的、 對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0017] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 W及藥物制品輔劑。將本發明的藥物組合物W單位體重服用量的形式使用。本發明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質體或乳劑等。
【附圖說明】 陽〇1引圖1為化合物（I)結構式；
[0019] 圖2為化合物（I)理論ECD值與實驗ECD值比較；
[0020] 圖3為化合物（I)處理后U251細胞桐調亡率的變化。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不W此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可W對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。 陽02引實施例1 :化合物（I)分離制備及結構確證
[0023] 試劑來源：乙醇、石油酸、乙酸乙醋、正下醇、二氯甲燒為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0024] 制備方法：(a)將白背葉的干燥葉（10kg)粉碎，用85%乙醇熱回流提取（2^X3 次），合并提取液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油酸（化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水 飽和的正下醇0LX3次）萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物（431g)和正下醇 萃取物；化）步驟（a)中乙酸乙醋萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10 %乙醇洗脫8個柱 體積，再用80 %乙醇洗脫10個柱體積，收集80 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得80 %乙醇洗脫物 浸膏（157g) ;(c)步驟化）中80%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為75:1(8 個柱體積）、45:1 (8個柱體積）、25:1 (8個柱體積）、12:1 (8個柱體積）和1:1巧個柱體積） 的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（C)中組分4 (49g)用正相硅膠進一步 分離，依次用體積比為20:1 (8個柱體積）、12:1 (10個柱體積）和5:1 (8個柱體積）的二氯 甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟（d)中組分2 (23g)用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75%的甲醇水溶液等度洗脫，收集10-12個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I) (34mg)。 陽0巧]結構確證：HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z395. 1508,結合核磁特征可得分子式 為C2化A，不飽和度為10。核磁共振氨譜數據5H(Ppm，DMS0-d6,600MHz) :H-1(2.98， d)，H-1 (2. 73,d)，H-3 (6. 85,s)，H-6 (2. 63,m)，H-6 (1. 25,t，J= 14. 4)，H-7 (1. 24,m)， H-8 (1. 55,m)，H-8 (1. 78,m)，H-9 (2. 52,dd，J= 8. 4, 2. 4)，H-10 (2. 06,dt，J= 12. 0, 2. 4)， 82,ddd，J= 10. 2,8. 4，1. 2)，H-12(4. 94,br，s)，H-14化.41，br，s)，H-15(7. 33， br，s)，H-16 (7.33,br，s)，H-17 (0.99,dd)，H-19 (1.20,s)，18-0Me(3.61，s);核磁共 振碳譜數據 5c(卵m，DMSO-de，150Hz) :38. 3 (邸2,1-C)，198. 9 (C，2-C)，130. 0 (CH，3-C)， 156. 9 (C，4-C)，36. 1 (C，5-C)，32. 9 (邸2, 6-C)，34. 8 (CH，7-C)，24. 2 (邸2, 8-C)，42. 0 (CH， 9-C)，37. 6 (CH，10-C)，39. 2 (CH，11-C)，78. 5 (CH，12-C)，123. 3 (C，13-C)，108. 2 (CH，14-C)， 143. 9 (CH，15-C)，138. 8 (CH，16-C)，12. 2 (邸3, 17-C)，167. 0 (C，18-C)，23. 1 (細3,19-C)， 177. 7(C，20-C)，51.3(CH3，18-0Me);碳原子標記參見圖1。NMR譜表明，該化合物含有立個 甲基[5冊.99((1(1，&-17)，1.20(3，&-19)和3.61(3，18-(116)]，^個亞甲基[5肥.98((1， H-1)，2. 73 (d，H-1)，2. 63 (m，H-6)，1. 25 (t，J= 14. 4Hz，H-6)，1. 55 (m，H-8)，1. 78 (m，H-8)]， 六個次甲基[5冊.85(s，H-：3)，1.24(m，H-7)，2. 52(dd，J= 8. 4,2. 4Hz，H-9)，2. 06(化， J= 12. 0,2. 4Hz，H-10)，2. 82(ddd，J= 10. 2,8. 4，1.2Hz，H-ll)，4. 94 化r，s，H-12); 5C130. 0 (C-3)，34. 8 (C-7)，42. 0 (C-9)，37. 6 (C-10)，39. 2 (C-11)，78. 5 (C-12)]，一個e單 取代巧喃環[5C123. 3 (C-13)，108. 2 (C-14)，143. 9 (C-15)和 138. 8 (C-16)]，兩個內醋幾基 [5C167. 0 (C-18)和 177. 7 (C-20) ]，W及一個a，P-不飽和幾基[5C198. 9 (C-2)]。根據 HMBC譜中H-12與C-14和C-16的相關性，可推斷巧喃環位于C-12位上。N犯SY譜中&-19 與H-10，H3-19與H-7,化及H-7與H-12的相關性，表明它們均為a取向。綜合氨譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，W及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如圖1所示，立 體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致（圖2)。
[0026] 實施例2:化合物（I)藥理作用試驗
[0027] 一、材料和儀器
[002引本實驗采用人腦惡性膠質母細胞瘤U251細胞株，購自美國模式菌種收集中屯、。DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；氯化鋼、氨氧化鋼、氯化鐘、氯化氧、氨氧化鋼、 憐酸氨二鋼、憐酸二氨鋼、憐酸二氨鐘、甲醇購自南京化工廠。化合物（I)自制，HPLC歸 一化純度大于98 %。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亞諷（DMEM)購自美國Sigma公司； Aimexin-V/PI細胞調亡試劑盒購自美國Invitrogen公司；細胞裂解液、0.25%膜蛋白酶、 CellCountingKit-8 試劑盒、青霉素、鏈霉素、Hoechst33258、細胞核染料DAPI、PMSF、 Westernblot凝膠配制試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒、考馬斯亮藍染色液、標準蛋白、5X 蛋白質變性緩沖液盒、E化超敏發光液、顯影定影試劑盒、X線膠片、硝酸纖維素膜、抗巧光 澤滅封片液購自江蘇碧云天生物研巧所。胎牛血清購自杭州四季青生物科技公司；兔抗人 P65抗體購自美國N0VUS公司；兔抗人化stonH3抗體購自美國CST公司；山羊抗兔HRP二 抗購自美國Santa化UZ公司；山羊抗兔巧光二抗購自美國Earth化公司。
[0029]-20°C低溫冰箱（海爾青島），-80°C低溫冰箱（海爾青島），低溫冰箱（海爾青島）， 高速離屯、機（飛鶴上海），培養皿/板（Coming美國），離屯、管（Coming美國），細胞培養箱 燈hermo美國），倒置顯微鏡（Olympus日本），巧光倒置相差顯微鏡狂EISS德國），多用途 恒溫水浴箱（躍進上海），電子天平儀（上海機密科學儀器），超凈