具有沉默突變的重組rsv、疫苗及其相關方法
【專利說明】具有沉默突變的重組RSV、疫苗及其相關方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2013年3月14日提交的美國臨時申請號61/781，228和2013年10月14日提交的美國臨時申請號61/890，500的優先權，兩者均通過引用以其全文結合。
[0003]背景
[0004]呼吸道合胞病毒(RSV)導致下呼吸道感染。免疫功能低下的患者、早產兒和兒童尤其處于嚴重疾病的風險。RSV是嬰兒中病毒性死亡的主要原因。RSV治療集中于預防感染和改善呼吸。帕利珠單抗是可以預防性地給藥的一種人源化單克隆抗體。帕利珠單抗在RSV感染之后是無效的，并且保護在治療停止之后不久終止。疫苗目前不可用于RSV。候選減毒RSV疫苗由于在嬰兒中的次最優免疫原性和導致針對不希望的野生型序列的遺傳回復的次最優穩定性而已經失敗。參見騰(Teng)，傳染性病癥一一藥物靶標(Infect1usDisorders - Drug Targets)，2012，12 (2): 129-3。因此，需要發現為適當免疫源性的、足夠穩定的且安全用于嬰兒的一種減毒RSV疫苗。
[0005]由于遺傳密碼的冗余性，單個氨基酸由密碼子的多重序列編碼，這些密碼子有時被稱為同義密碼子。在不同物種中，同義密碼子或多或少頻繁地被使用，有時被稱為密碼子偏愛。將出現頻率過低的同義密碼子遺傳工程化成一種基因的編碼序列已顯示導致降低的蛋白質翻譯速率，而無蛋白質的氨基酸序列的變化。米勒(Mueller)等人報道通過密碼子偏愛的變化進行病毒減毒。參見科學(Science)，2008，320:1784。還參見W0/2008121992、W0/2006042156、伯恩斯(Burns)等人，病毒學雜志(J Virology)，2006，80 (7):3259 以及米勒等人，病毒學雜志，2006，80 (19):9687ο
[0006]盧昂戈(Luongo)等人報道通過反向遺傳學提高一種候選減毒活呼吸道合胞病毒疫苗的遺傳和表型穩定性。參見病毒學雜志，2012，86 (19): 10792。
[0007]道丘(Dochow)等人報道副粘液病毒聚合酶蛋白中的獨立結構域。生物化學雜志(J B1l Chem)，2012，287:6878 - 91。
[0008]美國專利8，580, 270報道RSV F多肽序列。美國專利7，951，384報道它涵蓋一種VLP RSV 疫苗。
[0009]在此引用的參考文獻并非對現有技術的承認。
[0010]概述
[0011]在某些實施例中，本披露涉及呼吸道合胞病毒(RSV)的多核苷酸序列。在某些實施例中，本披露涉及包含在此披露的所希望的核酸序列和突變體的分離或重組的核酸和多肽。在某些實施例中，還提供包含在此披露的核酸和多肽的分離或重組的RSV(例如，減毒重組RSV)，還提供適合用作疫苗的包含這類核酸、多肽和RSV基因組的免疫原性組合物。還涵蓋含有呈拷貝的核酸(例如，cDNA)形式的這些核酸和突變體的減毒或滅活的RSV。
[0012]在某些實施例中，本披露涉及分離的核酸、具有密碼子去優化的重組呼吸道合胞病毒(RSV)、由其產生的疫苗以及與其相關的疫苗接種方法。在某些實施例中，重組RSV病毒包含A2株系的基因NSl、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、以及L，品系19，或其Long株系或變體。在某些實施例中，密碼子去優化是在非結構基因NSl和NS2中并且任選地在一種基因G中且任選地在一種基因L中。在其他實施例中，基因SH被缺失。在其他實施例中，基因F被突變，例如，對應于RSV株系19F蛋白的殘基557的一種I至V突變。
[0013]在某些實施例中，本披露涉及編碼去優化的基因NSl和/或NS2以及一種野生型人RSV或變體的任選地基因G和任選地基因L的分離的核酸，其中這些核苷酸被取代，這樣使得用于產生Gly的密碼子是GGT，用于產生Asp的密碼子是GAT，用于產生Glu的密碼子是GAA，用于產生His的密碼子是CAT，用于產生Ile的密碼子是ATA，用于產生Lys的密碼子是AAA，用于產生Leu的密碼子是CTA，用于產生Asn的密碼子是AAT，用于產生Gln的密碼子是CAA，用于產生Val的密碼子是GTA，用于產生Tyr的密碼子是TAT或其組合。在某些實施例中，分離的核酸中的一種基因進一步包含這些單獨密碼子中的至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或全部的一種組合。在某些實施例中，分離的核酸中的一種基因包含這些密碼子中的至少20個、30個、40個或50個或更多個。
[0014]在某些實施例中，本披露涉及如在此披露的分離的核酸，其中核苷酸被取代，這樣使得用于產生Ala的密碼子是GCG，用于產生Cys的密碼子是TGT，用于產生Phe的密碼子是TTT，用于產生Pro的密碼子是CCG，用于產生Arg的密碼子是CGT，用于產生Ser的密碼子是TCG，或用于產生Thr的密碼子是ACG或其組合。在某些實施例中，含有該核酸的一種基因包含這些單獨密碼子中的至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個或全部的一種組合。在某些實施例中，分離的核酸中的一種基因進一步包含這些密碼子中的至少20個、30個、40個或50個或更多個。
[0015]在某些實施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼具有SEQ ID N0:5MGXiNx2Lsx3Ikx4Rlqnlx5X6Ndevallkitcyx7Dklix8Ltnalakax9Ihtiklngivfx1HvitssXiiX12CPX13Nx14ivvksnfttmpx15lx16nggyix17ex18x19elthcsqx20ngx21x22x23dnceikfsx24x25lx26dsx27mtx28yx29x3
°QX31SX32LLGX33DLX34X35的 NS1，其中 X 1-X35是任何氨基酸或 X 1是 S 或 C ;X 2是 S 或 T ;X 3是 M或V ;x4是V或I ;X 5是F或L ;X 6是D或N ;X 7是T或A ;X 8是H、L或Q ;X 9是V或T ;X 1(]是V或 I ;Xn是 D 或 E ;X 12是 1、A 或 V ;X 13是 N 或 D ;X 14是 N 或 S ;X 15是 V、I 或 A ;X 16是 Q 或 R ;X17是W或任何氨基酸；x 18是M或L ;X 19是M或I ;X 2°是P或L ;X 21是L或V ;X 22是L、M或I ;X23是D或V ;X 24是K或R ;X 25是K或R ;X 26是S或任何氨基酸；X 27是T或V ;X 28是N或D ;X29是M或I ;X 3°是N或S ;X 31是L或I ;X 32是E或D ；X 33是F或L ；X 34是N或H ;并且X 35是P或S或缺失。
[0016]在某些實施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼RSV的NS1，如以NCBI 登錄號 ΝΡ_044589.1、ΝΡ_056856.UP04544.UAEQ63513.UAFM55237.UAFV32554.1、Q86306.1、AFV32528.1、AFM55248.1、AFM95358.1、AFV32568.1、ACY68428.1、CBW45413.1、AC083290.UAFM55347.UCBW45433.UAEQ63459.UAFM55204.UAFV32572.UAFV32558.1、CBW45429.1、CBW45445.1、AFV32596.1、CBW45481.1、CBW47561.1、Ρ24568.1、AAR14259.1、CBW45451.1、 CBW45447.1、 CBW45471.1、 ΒΑΕ96914.1、 CBW45463.1、 CBW45473.1 或CBW45467.1提供的；或包含一個、兩個或三個氨基酸插入、缺失、取代或保守取代的變體。
[0017]在某些實施例中，本披露涉及一種分離的核酸，該分離的核酸包含SEQ ID NO:6或SEQ ID Ν0:7或與其具有60%、70%、80%、90%、95%或更大序列一致性的一個序列。
[0018]在某些實施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼具有SEQ ID Ν0:8,MxiTx2X3X4X5X6Tx7Qx8Lx9Itdmrpx1SxiiXi2Xi3Xi4Ixi5Sltxi6Xi7Iithxi8Fiylinxi9Ecivx2oKldEx21Qatx22x23flvnyemx24llhx25vgsx26x27ykkx28teyntkygtfpmpifix29hx30gfx31ecigx32kptkhtpiix33kyd
LNP 的 NS2，
[0019]其中X1-X33是任何氨基酸或
[0020]X1是 D 或 S ;X 2是 T、A 或 K ;X 3是 H、S 或 N ;X 4是 N 或 P ;X 5是 D、G 或 E ;X 6是 T 或N ;X7是 P、M、Q、S 或 A ;X 8是 R 或 G ;X 9是 M 或 I ;X 1(]是 L 或 M ;X 11 是 L、M 或 I ;X 12是 1、D 或E ;X13是 T 或 S ;X 14是 I 或 V ;X 15是 I 或 T ;X 16是 R 或 K ；R 17是 D 或 E ；R 18是 R 或 K ；R 19是 H或N ;X2°是R或K ;X 21是R或K ;X 22是F或L ;X 23是T或A ；X 24是K或N ；X 25是K或R ；X 26是T或A ;X27是K或I ;X 28是T或S ;X 29是N或任何氨基酸43°是0或6 331是1^或1 ;X32是I或V ;并且X33是Y或H。
[0021]在某些實施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼具有如以NCBI登錄號
[0022]NP_044590.1、NP_056857.1、CBW45420.1、AFM95337.1、CBW45416.1、CBW45430.1、AFV32529.1、Q86305.1、AEQ63383.1、CBW45424.1、AFM55546.1、CBW45444.1、P04543.2、AFM55326.UAFM55425.UAFM55381.UAFM55458.UAFM55216.UAAB59851.UAEQ63372.1、AFM55337.UCBW45426.UAFV32515.UAFV32519.UAAR14260.UCBW47562.UAFV32643.1、P24569.1、AFV32657.1、AFI25256.1、CBW45480.1、AFV32605.1、AEQ63580.1、AFV32627.1、AFV32665.UCBW45482.UCBW45478.UCBW45462.UAEQ63635.UCBW45448.UCBW45464.1、CBW45484.1或CBW45474.1提供的RSV的NS2的NSl ;或包含一個、兩個或三個氨基酸插入、缺失、取代或保守取代的變體。
[0023]在某些實施例中，本披露涉及一種分離的核酸，該分離的核酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10或與其具有60%、70%、80%、90%、95%或更大序列一致性的一個序列。
[0024]在某些實施例中，本披露涉及包含在此披露的核酸的重組載體。
[0025]在某些實施例中，本披露涉及包含在此披露的核酸的一種減毒重組RSV。
[0026]在某些實施例中，本披露涉及包含在此披露的載體或在此披露的一種減毒重組RSV的表達系統。
[0027]在某些實施例中，本披露涉及包含在此披露的減毒重組RSV的疫苗。
[0028]在某些實施例中，本披露涉及疫苗接種方法，這些方法包括向處于RSV感染風險的受試者給予有效量的在此披露的疫苗。
[0029]在某些實施例中，受試者年齡小于2個月或6個月、在I歲以下、早產、患有先天性心臟病或肺病，經受化學療法或移植，或被診斷患有哮喘、充血性心力衰竭或慢性阻塞性肺病、白血病或HIV/AIDS。
[0030]在某些實施例中，疫苗與莫維珠單抗、帕利珠單抗或針對RSV的F蛋白的抗原位點II中的表位的另一種人源化單克隆抗體組合給予。
[0031 ] 在某些實施例中，本披露涉及在此披露的載體，這些載體包含一種細菌人工染色體(BAC)和包含呼吸道合胞病毒(RSV)的一種核酸序列，并且該BAC含有對于在一種宿主細胞中產生一種感染性病毒顆粒來說必需的所有基因。該核酸序列可以是與一種調控元件可操作的組合的一種病毒基因組或反基因組。典型地，該細菌人工染色體包含與一種選擇性標志物(例如提供對一種抗生素的抗性的一種基因)可操作的組合的一種或多種基因，該一種或多種基因選自下組，該組由以下各項組成:因子F的oriS、repE、parA和parB基因。
[0032]該核酸序列可以是如在此所提供任選地突變的病毒(例如，任選地突變的RSV株系)的基因組或反基因組序列。在某些實施例中，表達載體是包含Mlu1、Cla1、BstBl、SacI限制性核酸內切酶切割位點和任選地位于野生型病毒序列的區域外部或位于編碼病毒基因的序列外部或位于病毒基因組或反基因組外部的一個AvrII限制性核酸內切酶切割位點的一種質粒。在某些實施例中，該核酸序列進一步包含與其可操作地組合的一種選擇性標志物或報道基因，例如，編碼一種熒光蛋白的一種基因。
[0033]在某些實施例中，本披露涉及包含在此披露的一種或多種載體的分離的細菌，并且在其他實施例中，本披露涉及一種包含在此披露的一種或多種載體的分離的細胞。在某些實施例中，該載體包含一個RSV反基因組和選自下組的一種或多種載體，該組由以下各項組成:編碼RSV的N蛋白的一種載體、編碼RSV的P蛋白的一種載體、編碼RSV的L蛋白的一種載體、以及編碼RSV的M2-1蛋白的一種載體。典型地，該載體包含一種調控元件(例如，啟動子)，并且分離的真核細胞表達活化該調控元件的一種核酸或多肽，例如，編碼活化該啟動子下游的轉錄的一種多肽。在某些實施例中，該啟動子是T7，并且活化該啟動子下游的轉錄的多肽是T7RNA聚合酶。
[0034]在某些實施例中，本披露涉及產生呼吸道合胞病毒(RSV)顆粒的方法，這些方法包括將具有一種BAC基因的一種載體和一個RSV反基因組插入一種分離的真核細胞中，并且在使得形成RSV病毒粒子的條件下將選自下組的一種或多種載體插入該細胞中，該組由以下各項組成:編碼RSV的N蛋白的一種載體、編碼RSV的P蛋白的一種載體、編碼RSV的L蛋白的一種載體、以及編碼RSV的M2-1蛋白的一種載體。將一種載體插入一種細胞中可通過物理注入、電穿孔或在使得該載體進入該細胞的條件下將該細胞與該載體進行混合來發生。
[0035]在某些實施例中，本披露涉及相較于其他株系，品系19F557突變體病毒的穩定性，以及使得表達品系19F的RSV甚至更熱穩定的在557處的val。其他株系中在557位的Val也可能穩定；因此557位對于熱穩定性來說是重要的。在某些實施例中，本披露涵蓋在任何F株系背景下，品系19F或其他RSV株系中在改進RSV病毒的熱穩定性的557位(任何氨基酸，例如，丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)的其他突變。
[0036]在某些實施例中，本披露涵蓋包含557位的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸(例如，SEQ IDNO: 17的557位中的丙氨酸或亮氨酸)的RSV F多肽。
[0037]在某些實施例中，本披露涉及RSV F多肽的某一所希望的序列，例如包含557位的纈氨酸的品系19序列，例如SEQ ID NO: 17 ;以及編碼這些多肽的重組核酸。在某些實施例中，本披露涵蓋包含編碼這些多肽的核酸的重組載體和包含所述載體的細胞。
[0038]在某些實施例中，本披露涉及免疫原性組合物，這些組合物包含免疫有效量的在此披露的重組呼吸道合胞病毒(RSV)、RSV多肽、RSV顆粒、RSV病毒樣顆粒和/或核酸。在某些實施例中，本披露涉及用于刺激個體的免疫系統產生針對RSV的保護性免疫應答的方法。在某些實施例中，在一種生理學上可接受的載體中向該個體給予免疫有效量的在此披露的一種RSV、多肽和/或核酸。
[0039]在某些實施例中，本披露涉及用于在此披露的用途的包含在此披露的核酸的藥物和疫苗產品。
[0040]在某些實施例中，本披露涉及在此披露的核酸或載體用于制造用于在此披露的用途的一種藥物的用途。
[0041]附圖簡要說明
[0042]圖1示出具有在人基因中和特定RSV株系中最少使用的密碼子的一個表。
[0043]圖2示出BEAS-2B(頂部)和Vero細胞系(底部)中kRSV-dNSlh的生長數據。kRSV-A2(空心圓圈)和kRSV-dNSh (實心圓圈)在37°(:下以0.01的MOI感染的HEp_2 (A)、Vero細胞(B)和BEAS-2B細胞(C)中以及在以0.2 (D)或2.0 (E)的MOI感染的分化NHBE/ALI細胞中的生長曲線。
[0044]圖3示出關于使用在此披露的某些實施例的病毒載量實驗的數據。在0.2的MOI下NHBE細胞感染的時間進程圖像，這些圖像示出由重組病毒產生的mKate2熒光。*P〈0.05
[0045]圖4示出在通過重組工程將galK操縱子插入BAC-RSV中之后的凝膠。MluI消化。泳道I，梯度標志物。微量制備BAC DNA (泳道2至7)。泳道8，親本BAC-RSV “C2”克隆。泳道9，含galK質粒。galK操縱子具有充當用于通過同源重組引入galK的標志物的一個Mlu I限制位點。
[0046]圖5示出在通過重組工程使galK操縱子從BAC-RSV中缺失之后的凝膠。含galK質粒(泳道2)、BAC微量制備DNA (泳道3-7)以及親本BAC-RSV克隆C2 (泳道8)的MluI消化。
[0047]圖6A-6E示意性地示出用于產生BAC-RSV的步驟。產生具有RSV區段的三種質粒(參見實驗)；A)將pKBS3在BstBl和Mlul位點處切割以便線性化，并且連接至一個寡核苷酸銜接子，從而提供PKBS5 ；B)將具有Sacl和Clal的pSynRSV#2切割且連接至pKBS5，從而提供PKBS5-2 ；C)將具有Avrll和Mlul的pSynRSV#3切割且連接至pKBS5_2，從而提供pKBS5_2_3 ；D)將具有BstBl和Sacl的pSynRSV#l切割且連接至pKBS5_2_3，從而提供pKBS5_l_2_3 ；E)。重組工程用于使兩個Clal位點之間的核苷酸缺失，從而產生pSynRSV-品系 19F。
[0048]圖7示出顯示指示具有F基因1557至V突變的一種RSV株系的免疫源性的數據。將小鼠用指示劑量的A2-K-品系19F、A2-品系19F-1557V或A2-K-A2GF感染并且在29天之后用RSV株系12-35激發。在激發后第4天測量肺病毒載量。虛線指示檢測限。
[0049]圖8示出指示具有A2-品系19F基因1557至V突變(SEQ ID NO: 17)的RSV株系的優異熱穩定性的數據。在所指示的溫度下孵育病毒并且每天測量病毒滴度持續6天。在4°C下的結果在病毒之間是統計學上顯著的(P〈0.01)。在37°C下的結果展示相同表型。
[0050]圖9示出株系19，I557V突變(SEQ ID NO: 17)(詢問序列)與典型RSV株系19序列(目標序列)的RSV序列比較。
[0051]圖10示出株系19，I557V突變(SEQ ID NO: 17)(詢問序列)與來自專利US7，951，384的序列61 (目標序列)的RSV序列比較。
[0052]圖10示出株系19，I557V突變(SEQ ID NO: 17)(詢問序列)與來自專利US8，580，270的序列12 (目標序列)的RSV序列比較。
[0053]圖12示出關于在此披露的實施例的減毒、功效和免疫源性的數據。(A)將6-8周齡 BALB/c 小鼠(η = 5/ 組)用 1.6 X 105FFU