一種小麥鈣網聯蛋白基因TaCRT1在植物耐旱中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物基因工程應用技術領域，具體涉及一種小麥鈣網聯蛋白基因TaCRTl在植物耐旱中的應用。
【背景技術】
[0002]干旱缺水是全球農業生產面臨的嚴重問題，也是制約糧食作物產量潛力發揮的最嚴重因素。因此，通過提高作物的耐旱能力從而增加作物產量，已成為農業可持續發展的重大需求。隨著分子生物學和基因工程研究的深入，利用基因工程技術改良作物的抗旱性已成為培育抗旱作物新品種的重要途徑之一。
[0003]在生存進化中，植物自身形成了一系列的調控機制來抵抗干旱脅迫，其中抗旱基因的表達是抗旱能力提升的本質原因。研究表明，與抗旱相關的基因主要包括兩類:一類為功能基因，包括低分子可溶性糖、小分子蛋白等基因，部分酶類，晚期胚胎發生豐富蛋白基因LEA;另一類為各種參與水分脅迫信號傳遞的調節基因，包括脫落酸(abscisic acid,ABA)、乙烯(ethylene，ΕΤΗ)等信號分子合成的關鍵酶類基因，DREB等轉錄因子編碼基因，蛋白質磷酸酶2Α及2C等基因，植物蛋白激酶編碼基因。
鈣網聯蛋白(Calreticulin，CRT)是真核生物內質網中一個重要的分子伴侶，不同生物體中的CRT蛋白序列存在較高的保守性，主要由N、P、C這三個保守的結構域及信號肽與內質網四肽滯留信號序列(HDEL或KDEL)構成。目前，動物鈣網聯蛋白已得到深入研究，結果表明CRT具有Ca2+的調控、細胞黏附、T-細胞的識別、基因的轉錄及轉錄后調控等多種功能，尤其作為分子伴侶在內質網中能幫助肽鏈的正確折疊裝配，防止錯誤折疊蛋白的積聚，有效去處錯誤蛋白對機體的脅迫作用。但植物鈣網聯蛋白基因功能的解析相對較少。
【發明內容】
[0004]技術要求
本發明所要解決的技術問題是提供小麥鈣網聯蛋白基因TaCRTl在植物耐旱性方面的應用，從而為培育耐旱植物新品種提供可能性。
[0005]本發明是這樣實現的:小麥鈣網聯蛋白基因TaCRTl在植物耐旱中的應用。
[0006]該基因用于植物耐受干旱脅迫生長環境。
[0007]本發明所述的小麥鈣網聯蛋白TaCRTl，它是具有序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白質。其氨基酸序列與核苷酸序列申請人已經通過在先申請的發明專利中公開。
[0008]含有上述TaCRTl蛋白的表達載體和轉基因細胞系也在本發明的保護范圍之內，利用現有分子生物學的方法可以得到不同的表達載體和轉基因細胞系。
[0009]小麥鈣網聯蛋白TaCRTl的編碼序列在培育耐旱植物中的應用。利用任何一種可以引導外源基因在植物中超量表達的載體，將本發明所提供的TaCRTl蛋白編碼序列導入植物細胞，可改變植物耐旱的轉基因細胞系及轉基因植株。使用載體時，其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或誘導型啟動子。為了便于對轉基因植物或轉基因細胞進行篩選，可以對載體進行加工，如加入抗生素標記基因(如潮霉素、卡那霉素和慶大霉素等)，加入抗生素標記基因之后的載體用于轉化，可以在轉化后的植物培養基中加入抗生素，抑制非轉基因細胞系和植株的生長，有助于快速和有效的獲得轉基因材料。為了便于觀察外源基因的表達，可以在載體中啟動子和外源基因之間或是外源基因與終止子之間加入報告基因(⑶S基因、GFP和螢火蟲熒光素報告基因)，構建外源基因和報告基因融合表達的載體，該載體用于遺傳轉化，可以觀察報告基因的表達與否和表達量高低，推測外源基因在植物體內的表達情況。為了轉基因植物釋放的安全性，也可以在構建載體時不攜帶任何篩選標記基因或非抗生素篩選標記基因，直接通過PCR鑒定或表型篩選鑒定。含有本發明的TaGiTl的表達載體可通過使用基因槍、農桿菌介導、發粉管通道、電擊、顯微注射、Ti質粒、Ri質粒或植物病毒等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化后的植物細胞培育成完整的植株。被轉化的植株既可以是雙子葉植物，也可以是單子葉植物，如:水稻、棉花、小麥、大豆、油菜、煙草、擬南芥、大麥、高粱、玉米、黃瓜、番茄、白菜、蘿卜、楊樹、草坪草、苜蓿、藥材和花卉等。
[0010]小麥I丐網聯蛋白TaCRTl的編碼序列可提尚植物的耐旱性。
[0011]有益效果
通過基因工程的方法將本發明提供的小麥鈣網聯蛋白TaCRTl轉入植物中，可以提高植物的耐旱性。由于該基因是糧食作物小麥本身存在的內源基因，因此，該基因的超量表達不會影響植物的食品安全性，可廣泛應用于各種植物的育種應用。
【附圖說明】
[0012]圖1為轉基因擬南芥與非轉基因擬南芥的比較；Col-0、非轉基因擬南芥；T1、轉基因擬南芥；
圖2為干旱脅迫處理轉基因與非轉基因擬南芥植株；Col-0、非轉基因擬南芥；T1、轉基因擬南芥；
圖3為轉基因植株T3種子在MS培養基上萌發對IuM ABA表現敏感；Col_0、非轉基因擬南芥；T1、轉基因擬南芥。
【具體實施方式】
[0013]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0014]本發明的實施例1:小麥鈣網聯蛋白TaCRTl的獲得:
以小麥{Triticum aestivum L)品種望水白(Wangshuibai)(南京農業大學應用基因組室保存)為材料，在開花期將赤霉菌孢子液噴灑穗部，所用孢子液為江蘇省范圍內強致病力赤霉菌菌株F4、F15、F17及F34的分生孢子混合液，接種后立即套帶保濕，同時用水接種做為對照。接種6小時、12小時、24小時后分別取麥穗，立即用液氮冷凍。取700mg凍存的麥穗，加入70mg的PVP于液氮中磨成粉末，加入5mL 10%三氯醋酸/丙酮振蕩混勻、-20°C沉淀I小時；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀重新懸浮于5mL冷丙酮中，_20°C放置2小時；4°C 15，OOOg離心15min，沉淀懸浮于80%的冷丙酮中，_20°C放置I小時，離心去丙酮，將沉淀干燥成粉。按每mg干粉加入10 μ L裂解液(7M脲，2Μ硫脲，4% CHAPS，1% CA, 0.3%蛋白酶抑制劑，50U/mL DNase I)的比例加入裂解液，4°C攪拌抽提15min后加入14mM的DTT ;4°C再攪拌20min，然后35，OOOg離心lOmin，上清即為蛋白抽提液。將蛋白提取液進行等電聚焦后，進行SDS-PAGE電泳，電泳緩沖液用Tris-Glycine-SDS (pH 8.3)緩沖液，溫度為17°C ;先用2.5W/膠預電泳30min后，再用5W/膠電泳至溴酚藍到玻璃板下緣為止。電泳結束后取下凝膠立即銀染。分析蛋白質的豐度與對照相比超過3倍的蛋白點，取一個分子量為47.2千道爾頓，等電點為4.30的蛋白點進行質譜分析，該蛋白電的肽質指紋圖譜數據與大麥蛋白T05705理論酶切的肽質指紋圖譜數據相匹配。用大麥蛋白T05705檢索小麥EST數據庫，并進行contigs的拼接，然后用Macvector軟件設計引物Pl，Pl引物如下:F-5’- TCCGATCGGATCGGGGTAAAG-3’； R_5’_ CCAGTGCTCGTAGATGCTTCCAG -3’。用英俊公司的Trizol試劑盒提取望水白穗部的總RNA，用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量，然后在分光光度計上測定RNA含量。采用Promega的反轉錄試劑盒進行反轉錄，合成單鏈cDNA為模板，用引物Pl擴增目標片段。PCR反應體系為25 μ L，包含5ng模板，F和R引物各5 pmol、2.5 μ? 1x PCR buffer、37.3 nmol MgC12、5 nmol dNTP、0.5 U 的 rTaq 聚合酶。擴增程序為:94°C 預變性 3 min，94°C 20s, 60°C 30s, 72°C 延伸 45s，30 個循環后，72°C反應5min。通過PCR擴增，獲得1248bp的核苷酸序列，將PCR產物克隆至pMD18_T載體，該序列編碼415個氨基酸。
[0015]本發明的實施例2:小麥鈣網聯蛋白TaCRTl編碼序列的應用:
以望水白穗部的總cDNA為模板，用引物進行PCR擴增。引物對如下:5’ -CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC-3’ ； 5’- GCTCGGATCCCTTCTCGTCATCAGAC-3’。將擴增得到的 PCR 產物用限制性內切酶ZAaI和進行酶切后，與經過同樣限制性內切酶進行酶切的雙元表達載體PBI121進行連接，獲得由CaMV35S啟動子啟動的TaGiTV基因超量表達載體。用凍融法將獲得的表達載體轉入農桿菌菌株LBA4404，，通過含有50 μ g/ml的卡那霉素和50 μ g/ml利福平的LB培養基進行篩選，獲得陽性克隆。參照1998年Clough and Bent的方法，將攜帶有基因超量表達載體的農桿菌菌液浸泡擬南芥花朵進行遺傳轉化，收獲得到的擬南芥種子種植于含有50 μ g/ml的卡那霉素的I / 2MS培養基上進行篩選，獲得目的基因超量表達的抗卡那霉素的轉基因擬南芥。對于轉化的轉基因植株，我們首先提取基因組DNA,5’-CAGCTCTAGAATGTTCTTCCAGGAGAAGTTC-3’ ； 5’ - GCTCGGATCCCTTCTCGTCATCAGAC-3’進行PCR鑒定。對于PCR陽性的轉基因植株，提取總RNA，經過DNAse I處理后，進行反轉錄合成cDNA第一鏈，以cDNA第一鏈為模板，用與檢測DNA相同的PCR引物和程序進行轉錄水平的鑒定。擬南芥自交繁殖后，將T3代轉基因擬南芥和非轉基因擬南芥種子播種在裝有營養土的盆缽，在光照培養箱內正常生長(圖1)。3星期后，停止澆水做干旱處理，同時用水處理做對照。隨著處理時間的延長，對照與轉基因植株的生長都受到顯著的抑制，葉片萎蔫，3星期后做復水處理(圖2)。轉基因植株能迅速恢復生長，非轉基因植株大部分死亡，少部分緩慢恢復生長。轉基因植株T3種子在MS培養基上萌發表現對IuM ABA表現敏感，轉基因種子萌發受到明顯抑制。
[0016]
本發明涉及的序列及記號分列如下:(I) SEQ ID N0.1的信息
(1)序列特征:
㈧長度:1131bp
(B)類型:核苷酸
(C)鏈性:單鏈
(D)拓撲結構:線性
(ii)分子類型:核苷酸
(iii)序列描沭:SEQID N0.1
(2)SEQ ID N0.2的信息
(i)序列特征:
(A)長度:377a.a
(B)類型:氨基酸
(C)鏈性:單鏈
(D)拓撲結構:線性
(ii)分子類型:蛋白質
(iii)序列描沭:SEQID N0.2。
【主權項】
1.一種小麥鈣網聯蛋白基因TaCRTl在植物耐旱中的應用。2.根據權利要求1所述的小麥鈣網聯蛋白基因TaCRTl在植物耐旱中的應用，其特征在于:該基因用于植物耐受干旱脅迫生長環境。
【專利摘要】本發明提供了一種小麥基因Ta<i>CRT1</i>在耐旱植物體培育中的應用。轉化該基因的植物體可耐受干旱脅迫的生長環境。本發明經過一系列實驗研究，發現該基因可調控植物對干旱引起的脅迫反應，表現出耐旱特性，證明該基因在植物的耐旱方面有著巨大的潛在應用功能。通過將該基因超表達并轉化進植物體，可以獲得耐干旱脅迫相關的轉基因植物品種，從而實現植物的耐旱功能。本發明為培育耐旱轉基因作物新品種奠定了理論和生產實踐基礎。
【IPC分類】C12N15/29, A01H5/00, C12N15/84
【公開號】CN105132456
【申請號】CN201510574626
【發明人】向陽, 杜才富, 馬正強, 張敏琴, 王云, 宋敏, 王大紅
【申請人】貴州省油菜研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月11日