的偶聯物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及脂溶性維生素的偶聯物及其制備方法與應用，尤其涉及維生素D3的 偶聯物及其制備方法與應用。屬于維生素免疫檢測領域。
【背景技術】
[0002] 本發明涉及的下列名稱適用于整個說明書和權利要求書： BSA :牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin), Sigma 公司產品 PBS:磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline) (0.01M,pH= 7.40) cBSA:經乙二胺修飾的牛血清蛋白 透析膜：美國聯合炭化（United Carbide)公司產品 維生素D3:中國標準品質檢所 CDI :N，N'_羰基二咪唑，Sigma公司產品 DMAP: 4-二甲氨基P比啶，Sigma公司產品 維生素D是一種脂溶性類固醇激素前體，主要由皮膚經光照后產生。維生素D本身無 生物活性，必須在肝臟和腎臟相繼接收2次羥基化才能生成具有生物活性的1，25-羥基維 生素D。維生素D的兩種重要形式包括維生素D 3 (膽鈣化醇）和維生素D2 (麥角鈣化醇)。 維生素D3 (膽鈣化醇）主要是由人體自身合成的，人體的皮膚含有一種膽固醇，經陽光照射 后，就變成了維生素D3。所以，如果孩子能充分接受陽光直射皮膚4-6小時以上的話，自身 合成的維生素D 3，就基本上能滿足。但是紫外線照射帶來的皮膚癌上升、空氣的污染、各地 天氣變化等問題的影響下，各國人群接受日照的時間都在減少，并且很多國家明確規定要 限制接受日照的時間，因此全世界范圍內維生素D均呈現廣泛缺乏的現象。
[0003] 中國營養協會建議中國兒童和成人的可耐受最高攝入量為800IU/d。但從國 際對D 3的應用看來，大部分國家在日照較少的季節，對嬰幼兒的日攝入量已經提高到 800-1000IU/d，而孕婦和普通成人如果檢測為維生素D3缺乏，在開始1-2個月，日攝入量會 要求提高到2000 IU/d甚至更多。通過膳食來源的維生素D3-般不會引起中毒，也就是說 天然的維生素D3，和食品級的天然維生素D 3補充劑一般不會引起中毒。而大劑量的化學維 生素D3和強化維生素D 3的奶制品有發生維生素D 3過量和中毒的可能。因此，檢測營養強 化食品中維生素D3的含量非常有必要。
【發明內容】
[0004]在脂溶性維生素含量檢測中，儀器法如液相色譜法和質譜等是應用最廣泛的方 法。雖然這些方法準確，穩定，可靠，但是由于儀器法價格昂貴，費事較長，且造成有機溶劑 污染，需要大型儀器設備，需要專門的技術人員，所以難于應用于現場操作。酶聯免疫檢測 法（ELISA)提供了一種極好的檢測手段。該方法具有快速，準確，簡易，不需要專人操作等 優點，這使得ELISA法成為一種理想的檢測手段。酶聯免疫檢測法的核心是需要高質量的 抗體。維生素D3是一種小分子有機化合物，不具有免疫原性，稱之半抗原。所以，必須把微 生物D3轉化為能引發動物免疫系統產生抗體的免疫原(又稱之為完全抗原)。經檢索，世界 上尚未有關于維生素D3的免疫原合成及抗體制備過程的報道，而且維生素D3的ELISA試 劑盒大都購于國外，保存期短，價格高，遠不能滿足檢測需要，因此研究維生素D3的免疫原 的合成及抗體制備顯得格外重要。
【具體實施方式】
[0005] 實施例1 (1)溶液A的制備：在50mL圓形反應瓶內，攪拌中（120轉/分鐘)，加入維生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應4小時生成維生素D3與⑶I的活性中間體。
[0006] (2)溶液 B 的制備：在 25°C下，取 cBSA171mg (0? 0025mmol)溶于 15mL PBS (pH = 7. 4，0. 01M)中。在磁力攪拌下（120轉/分鐘）將A液逐滴加入B液中，反應6小時得溶 液B0
[0007] (3)制備維生素D3免疫原：將溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小時 更換一次透析液，連續透3天。然后，用蒸餾水透3天，每8小時更換一次透析液。收集透 析液凍干，得到150mg白色固體粉末。通過紫外吸收光譜(吸收值)確定產物偶聯情況。本 發明的維生素D3的免疫原在274nm處有特征紫外吸收峰。
[0008] 實施例2 (1)溶液A的制備：在50mL圓形反應瓶內，攪拌中（120轉/分鐘)，加入維生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應6小時生成維生素D3與⑶I的活性中間體。
[0009] (2)溶液 B的制備：在 28°C下，取 cBSA225. 72mg(0? 0033mmol)溶于 15mL PBS(pH =7. 4，0. 01M)中。在磁力攪拌下（120轉/分鐘）將A液逐滴加入B液中，反應6小時得 溶液B。
[0010] (3)制備維生素D3免疫原：將溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小時 更換一次透析液，連續透3天。然后，用蒸餾水透3天，每8小時更換一次透析液。收集透 析液凍干，得到165mg白色固體粉末。通過紫外吸收光譜(吸收值)確定產物偶聯情況。本 發明的維生素D3的免疫原在274nm處有特征紫外吸收峰。
[0011] 實施例3 (1)溶液A的制備：在50mL圓形反應瓶內，攪拌中（120轉/分鐘)，加入維生素D3 19. 20 11^(0.0501111]1〇1)，11^'-幾基二咪挫（〇01)16.2 11^以及4-二甲氨基[1比啶（0獻?）0.6 11^ 溶于2mL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應8小時生成維生素D3與⑶I的活性中間體。
[0012] (2)溶液 B 的制備：在 30°C下，取 cBSA114. OOmg (0? 0017mmol)溶于 15mL PBS(pH =7. 4，0. 01M)中。在磁力攪拌下（120轉/分鐘）將A液逐滴加入B液中，反應6小時得 溶液B。
[0013] (3)制備維生素D3免疫原：將溶液B用PBS(pH= 7. 40，0. 01M)，透析，每8小時 更換一次透析液，連續透3天。然后，用蒸餾水透3天，每8小時更換一次透析液。收集透 析液凍干，得到135mg白色固體粉末。通過紫外吸收光譜(吸收值)確定產物偶聯情況。本 發明的維生素D3的免疫原在274nm處有特征紫外吸收峰。
【主權項】
1. 一種維生素D3的偶聯物，由維生素D3半抗原與產生免疫原性的載體蛋白偶聯構成， 所述載體蛋白物質為優選蛋白。2. 如權利要求1所述的維生素D3的偶聯物，其中所述的蛋白質是牛血清蛋白。3. 如權利要求2所述的維生素D3的偶聯物，其結構通式為（I);(I) 其中m:為與一個牛血清蛋白結合的分子數，n為整數1~20 BSA為牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin),分子量范圍是 6. 6KDa~6.9KDa 上述偶聯物顯示出如下物化特征： 外觀：白色粉末固體 紫外吸收光譜：265nm。4. 如權利要求3所述的維生素D3的偶聯物，其特征是：所述n優選為整數10~20,分子 量范圍是 6. 7KDa~6. 8KDa。5. 權利要求1~4中任一項所述的維生素D3的偶聯制備方法，其特征是，將維生素D3與 產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物，并 保持該偶聯物的生物活性不變。6. 如權利要求5所述維生素D3的偶聯物的制備方法，該方法步驟如下： 溶液A的制備：將維生素D3，N，N'_羰基二咪唑（⑶I)以及4-二甲氨基吡啶（DMAP)，以 摩爾比為I:2 :0. 1的比例溶于ImL二甲基甲酰胺（DMF)中，反應生成維生素D3與⑶I的 活性中間體，備用； cBSA的制備：在冰浴條件下，先將乙二胺溶于pH為7. 38~7. 56,濃度為0. 01M~0. 02M磷酸緩沖液中，用濃鹽酸調pH為7. 38~7. 56 ;以乙二胺：BSA:EDC的摩爾比為15~25: 1: 15~25的量稱取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20°C± 5°C條件下攪拌反應2~4 小時；將乙二胺與BSA的反應溶液在(TC~4°C條件下，用上述磷酸鹽緩沖液攪拌透析70~80 小時，然后用蒸餾水透析20~30小時，每隔6小時換一次液； 最后，收集凍干，得到白色固體粉末； 溶液B的配制：把cBSA溶于pH為7. 38~7. 56,濃度為0. 01M-0. 02M的磷酸鹽緩沖液中， 配成10. 0 ± 5.Omg/mL的溶液，備用； 按維生素〇3與(^5六的摩爾比為20~35:1量分別取溶液A和溶液B，在20°C± 5°C條 件下，把溶液A逐滴加入到不斷攪拌狀態下的溶液B中，反應6~8小時，得到溶液C; 溶液C用磷酸鹽緩沖液攪拌透析70~80小時，然后用蒸餾水透析20~30小時，每隔6小 時更換一次透析液； 收集凍干，得到白色固體物質。
【專利摘要】本發明公開了一種通式（I）的維生素D3的偶聯物，由維生素D3半抗原與產生抗原性的載體物質優選牛血清蛋白偶聯構成，其中n為與一個牛血清蛋白分子結合的維生素D3的分子數，n為整數1~20，BSA為牛血清蛋白，分子量范圍是6.6KDa~6.9KDa。本發明還公開了所述的偶聯物制備方法，即將維生素D3與產生免疫原性的載體物質連接起來，結合為具有誘發動物免疫系統產生抗體的偶聯物。本發明具有特異性好、準確度高，快速簡便的特點，為用所述偶聯物制備維生素D3的酶聯免疫檢測試劑提供了基礎。
【IPC分類】C07K14/765, C07K16/44, C07K1/107
【公開號】CN105131108
【申請號】CN201510521823
【發明人】郗日沫, 董亞慶, 尹永梅, 孟萌, 李小剛, 張麗沙, 王玉芬, 宋兆瑞, 龍浩, 許坤
【申請人】南開大學, 天津三箭生物技術有限公司, 李小剛
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月24日