一種蛋白質分離純化的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及蛋白質分離領域，具體涉及一種蛋白質分離純化的方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質的分離純化是用生物工程下游技術從混合物之中分離純化出所需目的蛋白質的方法，在生物化學研究應用中使用廣泛，是當代生物產業的核心技術。
[0003]蛋白質的分離純化既要利用不同蛋白間內在的相似性，又要利用其差異，其中，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，以及利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學活性都會有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物中提取出來。但是，目前蛋白質的分離純化面臨的技術問題在于:其技術難度高、成本高。例如，一個生物藥品的成本75%都花在下游蛋白質分離純化當中。
[0004]在蛋白質的生物化學研究中，電泳可以根據不同的電荷差異(在沒有變性的凝膠電泳中)或者蛋白質的分子量的大小(在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)將蛋白混合物分離而成為不同蛋白條帶。在一維凝膠電泳中，變性凝膠電泳的主要用途是從凝膠中檢測和定位蛋白質，同時也可以用來從混合物中進一步分離純化蛋白質。一維凝膠電泳中使用最廣泛的是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。在典型的SDS-PAGE中，樣品用還原劑巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)和高濃度的SDS(2% )進行處理。還原劑可以使由二硫鍵連接起來的蛋白質分解，SDS將結合到蛋白質基團上。經過這些處理，蛋白質將按照其分子量在電場中移動。同非變性凝膠電泳相比，SDS-PAGE有更高的分辨率，更重要的是提供了一個可靠的方法來判斷蛋白質分子量的大小。雖然SDS-PAGE和非變性凝膠電泳已經廣泛的應用于生物化學研究，但是它們有幾個不同點。首先，非變性凝膠電泳分辨率比較低，從而限制了它的使用。其次，在收集活性蛋白質和研究蛋白質的催化性能的試驗中，因為蛋白質都被固定到聚丙烯酰胺凝膠中，所以蛋白質在凝膠中的催化效率不如在溶液狀態下高。第三，因為許多蛋白質在通常條件下是以聚合體的形式存在，所以在非變性凝膠電泳中很難評價單個蛋白質的性能。換句話說，SDS-PAGE提供了一個更好的純化蛋白質的方法，但是如果需要觀察離散的蛋白條帶，電泳過程仍然僅限于部分純化蛋白質的制備。如果從微生物、植物或動物中制備一種蛋白質，那么樣品中就有成千上萬種蛋白質，所以幾乎不可能將如此多的蛋白質通過SDS-PAGE分離成離散的條帶并純化出來。此外，在SDS-PAGE中蛋白質樣品的處理第一步通常是使蛋白質變性。樣品的處理過程通常是添加高濃度的還原劑和去污劑，并在100°C下水浴5分鐘。大多數蛋白質在這些條件下會變性，這樣會使我們感興趣的蛋白質的功能鑒定變的非常困難。
【發明內容】
[0005]為解決上述問題，本發明提供了一種蛋白質分離純化的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采取的技術方案為:
[0007]—種蛋白質分離純化的方法，包括如下步驟:
[0008]S1、向待分離溶液中添加緩沖溶液和親水性有機溶劑，攪拌均勻，形成雙水相萃取體系，靜置后，收集上相萃取液；
[0009]S2、將步驟SI收集的上相萃取液經蒸餾回收溶劑后過疏水層析柱，先用平衡液洗脫至無蛋白流出，再用洗脫液梯度洗脫，收集蛋白餾分；
[0010]S3、將S2收集的蛋白餾分加入CuSO4溶液，使Cu 2+與蛋白充分結合，得到蛋白生物樣品上樣液；
[0011]S4、將步驟S2得到的蛋白生物樣品上樣液加樣至上樣口，施加電壓開始電泳，電泳結束后，得到凝膠膠條；
[0012]S5、將所得的凝膠膠條切下后橫放于分離膠上，加入指示劑，進行電泳分離，電泳結束后，取出凝膠依次通過蛋白質洗脫板和分子半透膜分離，回收蛋白質。
[0013]其中，所述緩沖溶液包含以下組分:
[0014]55mmol/L pH 為 6.6 的 Tris-HCl，45_110mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)，1.3_2.4 %SDS(m/v)(電泳級)，0.035-0.05% (m/v)溴酸藍，17-26% (v/v)甘油。
[0015]其中，所述有機溶劑為天然來源的松節油衍生物。
[0016]其中，所述松節油衍生物為蒎烯的異構、歧化產物。
[0017]其中，所述分離膠由以下組分制備而成:
[0018]丙烯酰胺混合液11% _16%，其中，丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和雙甲叉丙烯酰胺質量比為17.55-23.95: I ；
[0019]尿素29-37% ;3mol/l pH為8.35的三羥基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液20-25%;十二烷基硫酸鈉(SDS)0.15-0.2% ;過硫酸銨0.36-0.82% ；
[0020]四甲基乙二胺(TEMED)0.038% -0.081% ;余量為去離子水。
[0021]其中，所述蛋白質洗脫板的材料為氯化聚丙烯、聚乙烯或聚苯丙烯中的一種。
[0022]其中，所述分子半透膜為聚酰胺半透膜、乙酸纖維素半透膜、聚砜樹脂半透膜或聚醚砜樹脂半透膜中的一種。
[0023]本發明具有以下有益效果:
[0024]能夠有效地分離復雜的蛋白質混合物為單一的蛋白質；提高了蛋白質的分離和純化效率并且保持了蛋白質的功能或酶活性，操作簡便。
【具體實施方式】
[0025]為了使本發明的目的及優點更加清楚明白，以下結合實施例對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0026]本發明實施例提供了一種蛋白質分離純化的方法，包括如下步驟:
[0027]S1、向待分離溶液中添加緩沖溶液和親水性有機溶劑，攪拌均勻，形成雙水相萃取體系，靜置后，收集上相萃取液；
[0028]S2、將步驟SI收集的上相萃取液經蒸餾回收溶劑后過疏水層析柱，先用平衡液洗脫至無蛋白流出，再用洗脫液梯度洗脫，收集蛋白餾分；
[0029]S3、將S2收集的蛋白餾分加入CuSO4溶液，使Cu 2+與蛋白充分結合，得到蛋白生物樣品上樣液；
[0030]S4、將步驟S2得到的蛋白生物樣品上樣液加樣至上樣口，施加電壓開始電泳，電泳結束后，得到凝膠膠條；
[0031]S5、將所得的凝膠膠條切下后橫放于分離膠上，加入指示劑，進行電泳分離，電泳結束后，取出凝膠依次通過蛋白質洗脫板和分子半透膜分離，回收蛋白質。
[0032]所述緩沖溶液包含以下組分:
[0033]55mmol/L pH 為 6.6 的 Tris-HCl，45_110mmol/L DTT (二硫蘇糖醇)，1.3_2.4 %SDS(m/v)(電泳級)，0.035-0.05% (m/v)溴酸藍，17-26% (v/v)甘油。
[0034]所述有機溶劑為天然來源的松節油衍生物。
[0035]所述松節油衍生物為蒎烯的異構、歧化產物。
[0036]所述分離膠由以下組分制備而成:
[0037]丙烯酰胺混合液11% _16%，其中，丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和雙甲叉丙烯酰胺質量比為17.55-23.95: I ；
[0038]尿素29-37% ;3mol/l pH為8.35的三羥基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液20-25%;十二烷基硫酸鈉(SDS)0.15-0.2% ;過硫酸銨0.36-0.82% ；
[0039]四甲基乙二胺(TEMED)0.038% -0.081% ;余量為去離子水。
[0040]所述蛋白質洗脫板的材料為氯化聚丙烯、聚乙烯或聚苯丙烯中的一種。
[0041]所述分子半透膜為聚酰胺半透膜、乙酸纖維素半透膜、聚砜樹脂半透膜或聚醚砜樹脂半透膜中的一種
[0042]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、向待分離溶液中添加緩沖溶液和親水性有機溶劑，攪拌均勻，形成雙水相萃取體系，靜置后，收集上相萃取液； 52、將步驟SI收集的上相萃取液經蒸餾回收溶劑后過疏水層析柱，先用平衡液洗脫至無蛋白流出，再用洗脫液梯度洗脫，收集蛋白餾分； 53、將S2收集的蛋白餾分加入CuSO4溶液，使Cu2+與蛋白充分結合，得到蛋白生物樣品上樣液； 54、將步驟S2得到的蛋白生物樣品上樣液加樣至上樣口，施加電壓開始電泳，電泳結束后，得到凝膠膠條； 55、將所得的凝膠膠條切下后橫放于分離膠上，加入指示劑，進行電泳分離，電泳結束后，取出凝膠依次通過蛋白質洗脫板和分子半透膜分離，回收蛋白質。2.根據權利要求1所述的一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，所述緩沖溶液包含以下組分:55mmol/L pH 為 6.6 ^ Tris-HCl, 45-11OmmoI/L DTT (二硫蘇糖醇)，1.3-2.4% SDS (m/V)(電泳級)，0.035-0.05% (m/v)溴酚藍，17-26% (v/v)甘油。3.根據權利要求1所述的一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，所述有機溶劑為天然來源的松節油衍生物。4.根據權利要求3所述的一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，所述松節油衍生物為蒎烯的異構、歧化產物。5.根據權利要求1所述的一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，所述分離膠由以下組分制備而成: 丙烯酰胺混合液11% -16%，其中，丙烯酰胺混合液中丙烯酰胺和雙甲叉丙烯酰胺質量比為 17.55-23.95: I ； 尿素29-37%;3mol/l pH為8.35的三羥基甲烷鹽酸(Tris-HCl)緩沖液20-25%;十二烷基硫酸鈉(SDS)0.15-0.2% ;過硫酸銨0.36-0.82% ； 四甲基乙二胺(TEMED)0.038%-0.081% ;余量為去離子水。6.根據權利要求1所述的一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，所述蛋白質洗脫板的材料為氯化聚丙烯、聚乙烯或聚苯丙烯中的一種。7.根據權利要求1所述的一種蛋白質分離純化的方法，其特征在于，所述分子半透膜為聚酰胺半透膜、乙酸纖維素半透膜、聚砜樹脂半透膜或聚醚砜樹脂半透膜中的一種。
【專利摘要】本發明公開了一種蛋白質分離純化的方法，包括如下步驟：向待分離溶液中添加緩沖溶液和親水性有機溶劑，攪拌均勻，收集上相萃取液；將收集的上相萃取液經蒸餾回收溶劑后過疏水層析柱，先用平衡液洗脫至無蛋白流出，再用洗脫液梯度洗脫，收集蛋白餾分；將收集的蛋白餾分加入CuSO4溶液，使Cu2+與組蛋白結合，加樣至上樣口，施加電壓開始電泳，電泳結束后，將所得的凝膠膠條切下后橫放于分離膠上，加入指示劑，進行電泳分離，電泳結束后，取出凝膠依次通過蛋白質洗脫板和分子半透膜分離，回收蛋白質。本發明能夠有效地分離復雜的蛋白質混合物為單一的蛋白質；提高了蛋白質的分離和純化效率并且保持了蛋白質的功能或酶活性，操作簡便。
【IPC分類】C07K1/36, C07K1/14, C07K1/26, C07K1/34, C07K1/20
【公開號】CN105131080
【申請號】CN201510651770
【發明人】冀玉良, 高寶云, 李堆淑, 李丹青, 張軍
【申請人】商洛學院
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月30日