一種檢測肝癌標志物imp1抗原表位氨基酸序列及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種具有檢測肝癌標志物頂P1多肽片段。
【背景技術】
[0002] 肝癌是目前我國發病率和致死率位居第二位的惡性腫瘤，每年約有30萬例新發 肝癌，占全球50%以上。肝癌發展迅速、易轉移，是目前治療最困難、預后最差的惡性腫瘤之 一。然而，相對于乳腺癌、肺癌和前列腺癌等其他類型的惡性腫瘤，至今仍缺乏對肝癌發病 相關腫瘤標志物分子認識。大量研究表明，血清或血漿中的腫瘤相關抗原能誘導機體產生 自身抗體，在腫瘤患者血清中既存在腫瘤抗原，也存在針對該腫瘤抗原的自身抗體。因此， 既可以利用抗體檢測腫瘤抗原，也可以利用抗原檢測腫瘤抗原的自身抗體，但利用腫瘤自 身抗體檢測腫瘤的特異性和敏感性均比利用腫瘤抗原檢測腫瘤要高得多。很多腫瘤相關抗 原不僅在腫瘤患者體內存在，在正常人體內也存在，因此檢測腫瘤相關抗原作為診斷依據 可信性差。而腫瘤自身抗體在正常人體內含量很低檢測不到或根本不存在，若體內腫瘤自 身抗體水平明顯增高，則表明體內存在異常免疫情況，表明體內相關抗原水平發生波動，預 示疾病的存在或原有疾病加重。 近年來的研究表明，在惡性腫瘤體積發展到可用現代影像學技術檢出之前3-5年，患 者血中可出現高濃度的腫瘤相關抗原自身抗體。因此，檢測血中腫瘤相關抗原自身抗體具 有預測腫瘤發病風險和早期診斷腫瘤的重要價值。是腫瘤臨床診斷領域的重點發展方向之 一。在國外已有診斷肺癌和乳腺癌的早期診斷試劑盒市售。然而，目前所報道的自身抗體 檢測方法敏感度低，特異性差，假陰性比率可高達50%以上。其主要原因是由于每一種腫瘤 相關抗原自身抗體在癌癥患者中的陽性檢測率平均在10%左右。如何提高診斷試劑敏感度 是當前需要亟待解決的關鍵問題。比較行之有效的方法是尋找新的可充當腫瘤標志物的自 身抗體，然后與現有已知的腫瘤相關抗原自身抗體組合成具有敏感度高和特異性強的診斷 試劑盒。 頂P1基因定位于llpl3,包含10個外顯子，48個氨基酸。頂P1和p62蛋白在氨基酸 水平有大約66%到70%的同源性，屬于同一mRNA結合蛋白家族。頂P1主要在早期胚胎發 育階段和妊娠中期表達，其與胰島素樣生長因子II(IGF-II)的不同轉錄物結合，參與調 節IGF-IImRNA的定位、穩定、反轉錄及翻譯，常常在許多腫瘤中過度表達，被認為是一種癌 胚蛋白。IGF-II是一種包括67個氨基酸的單鏈多肽，IGF-II基因中含有四個啟動子及九 個外顯子，其轉錄過程是由多個啟動子調節每個啟動子與不同的外顯子非翻譯調控區相關 聯，從而產生不同的轉錄產物。轉錄產物在胚胎期和成年期均特異性表達，其編碼的IGF-II 基因為一胚胎源性的生長因子，具有促進胚胎的發育及在細胞生長過程中促進細胞分裂增 殖等作用。IGF-II轉錄異常參與了許多疾病及腫瘤的發生發展。許多研究表明，頂P1不僅 與腫瘤的發生發展有關，而且與腫瘤的預后、轉移有關，有望成為某些腫瘤的分子標記物及 潛在的治療靶點。基于MP1在腫瘤組織和正常組織間表達的巨大差異和其在腫瘤發展中 的重要作用，IMP1作為一個預測、預后指標和抗癌治療靶點吸引了越來越多的關注。同時 提示我們其在肝癌早期診斷的應用價值較好，以及作為潛在生物標志物的可能。 本發明通過自行設計的頂P1抗原表位多肽，檢測肝癌患者血清及血漿中自身抗體表 達水平并開發相應的試劑，預測肝癌發生的危險性，并為制備肝癌早期診斷及預后預測試 劑盒奠定基礎。
【發明內容】
[0003]本發明要解決的技術問題是公開一種檢測肝癌標志物頂P1自身抗體的抗原表位 序列。 本發明同時公開了IMP1抗原表位的用途。 本發明提供的一種檢測肝癌標志物MP1自身抗體的抗原表位氨基酸序列為： H-PYGLIRGRIFFKIWPLSDFGFLRASPNGHRDC-OH 其純度 >95%，pH>7. 0。 本發明所述的IMP1抗原表位多肽在制備肝癌早期診斷試劑盒中的應用。 本發明利用自行設計的頂P1蛋白的線性多肽，采用ELISA法檢測肝癌患者血清及血漿 中抗頂P1蛋白的特異性自身IgG抗體。自身IgG抗體水平升高表明腫瘤患者體內頂P1蛋 白的表達量增加，預示患者可能出現原發性或繼發性肝癌，可以預測肝癌發生與復發的危 險性，指導臨床醫生對肝癌的早期診斷及預后預測。
抗原抗體的結合實際上只發生在抗原決定簇和抗體的抗原結合位點之間，兩者在空間 結構和空間構型上完全互補。因此抗原決定簇就可以代表整個蛋白與抗體結合的狀態與親 和特性。另外，以重組蛋白為抗原，要經過載體構建、轉染、表達、篩選、純化等繁瑣的過程， 蛋白空間結構復雜，抗原表位不易暴露，因此抗原抗體結合的特異性差。此外，ELISA法的 高靈敏性對純化技術的穩定性要求極高，成本昂貴。 發明人遵循以下原則設計線性多肽抗原：①選擇細胞膜蛋白表面區域；②選擇不形成a-helix的序列；③兩端的肽段比中間的排列合理；④避免蛋白內部重復；⑤避免同源性強 的肽段；⑥序列中盡量避免Cys和Glu，不可以有太多的Pro,但有1-2個Pro利于肽鏈結 構穩定，對產生特異性抗體有益。此外，該多肽抗原必須含有人類白細胞二類抗原（HLA)系 統的限制性表位，包括HLA-DR，HLA-DPandHLA-DQ的限制性表位。這些表位可被90%以 上華人群體的HLA二類抗原系統所識別。基于以上抗原設計原則及頂P1蛋白的生物學特 性，本發明利用生物信息學和多個表位預測模擬軟件，分析與抗原性相關的參數，設計了的 線性氨基酸序列。頂P1線性多肽抗原由32個氨基酸殘基組成，共含8個重疊表位，可檢測 至少8種單克隆抗體，具有高度的特異性。 ELISA法檢測抗原表位 我們采用ELISA方法，對收集的血液進行檢測，并得到各樣本0D值進行分析。 質控各樣本設雙復孔，取平均0D值。0D值離散度判定：離散度=0D1-0D2/0D1+0D2， 離散度< 〇. 1，為有效結果；離散度>〇. 1，為無效結果。取1〇〇份健康人血清等體積混合作 為質控血（Qualitycontrol,QC)，代表人群的普遍情況，每板均設2個QC血衆孔，以QC血 漿孔的0D值變異水平判定結果的穩定性，批間變異CV=所有批次QC孔SD/所有批次QC孔 0D均值〈20%。批內變異CV=每日各板QC孔SD/每日各板QC孔均值〈10%。 數據分析采用SPSS17. 0forwindows進行統計學分析。采用特異結合指數(Specificbindingindex，SBI)來判定IMP1抗原多肽與血衆自身抗體的結合程度，SBI= 頂PI0D值-NC0D值/QC0D值-NC0D值，NC為各樣本的陰性對照。利用啦驗分 別比較惡性肝癌組與健康對照之間SBI值之間的差異，a=0. 05。 ROC曲線是根據一系列不同的二分類方式(分界值或決定閾)，以真陽性率(靈敏度）為 縱坐標，假陽性率（1-特異度）為橫坐標繪制的曲線。R0C曲線下的面積值在1. 0和0. 5之 間。在AU>0. 5的情況下，AU越接近于1，說明診斷準確度越好。R0C曲線將靈敏度與特異 性以圖示方法結合在一起，可準確反映某分析方法特異性和敏感性的關系，是試驗準確性 的綜合代表。該發明采用Analyse-itforMicrosoftExcel軟件繪制R0C曲線，計算曲線 下面積（AU)，判定靈敏度和特異度。 本發明應用MP1抗原表位多肽檢測到肝癌患者血清及血漿中的MP1特異性自身IgG抗體，并且該反應具有高特異性和高靈敏性。 IMP1抗原表位多肽可用于制備肝癌早期診斷及預后預測試劑盒。
【附圖說明】
[0004] 圖1為肝癌患者體抗頂P1自身IgG抗體水平的R0C曲線分析圖（Diagonal segmentareproducedbyties.)〇
【具體實施方式】
[0005] 下面結合具體實施例子，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例子僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。 實施例1 試劑盒制備 1試劑試劑配制見Tab. 2~7。
2操作 (1) 包被：酶標板應用洗滌緩沖液清洗3遍，工作抗原用包被液稀釋至工作濃度，包被 于酶標板，4 °C過夜。 (2)加谷氨酸：洗滌緩沖液清洗3遍，用包被液稀釋谷氨酸至濃度lOOPg/ml，每孔 200W，37°C或室溫孵育lh ; (3)加血漿和質控對照（一抗）：酶標板應用洗滌緩沖液清洗3遍，利用包被液將血漿 稀釋至合適濃度，一般為1:100~1:500,每孔100W，37°C或室溫孵育lh; (4) 二抗孵育：洗滌緩沖液清洗3遍，利用包被液稀釋二抗標準液IgG，工作濃度 1:20000,每孔加100W，37°C或室溫孵育lh; (5) 顯色：洗滌緩沖液清洗3遍，每孔加100W底物顯色液，室溫避光30~45min。 (6) 檢測：每孔加50W終止液，lOmin內檢測，檢測波長為450nm，參考波長為630nm。 實施例2 肝癌患者的頂P1自身IgG抗體檢測 1樣本收集：本研究從吉林大學第三醫院、省腫瘤醫院選取經放射學檢查和組織學檢 查確診肝癌樣本103例。所有血清樣本采集前未經過任何抗癌治療，并具有全面的臨床資 料和信息。同時招募了健康對照組樣本121例。臨床訪談及影像學檢查均排除肝癌患病可 能。健康組與肝癌組在性別、年齡匹配，具有可比性（P>〇. 05) 2檢測結果：頂P1的自身抗體表達水平（Tab. 8):肝癌組與健康對照組相比存在統計 學差異=-5. 167,尸〈0? 001)。 R0C曲線分析：肝癌患者頂P1自身IgG抗體檢測在R0C曲線下面積為0. 723(SE=0. 030， 95%CI:0?568-0. 695)(圖 1 和Tab. 9)。 以上數據充分表明，利用本發明所設計的抗原表位多肽檢測得到的肝癌患者自身抗體IgG水平與正常健康組比較有顯著性統計學差異。 Tab. 8抗頂P1自身IgG抗體在肝癌患者和健康對照樣本中的表達水平
【主權項】
1. 一種檢測肝癌標志物MPl抗原表位多肽，其特征在于：氨基酸序列為 H- PYGLlRGRlFFKIffPLSDFGFLRASPNGHRDC -OH 其純度 >95%，pH>7. 0。2. 根據權利要求1所述的檢測肝癌標志物IMPl抗原表位多肽在制備肝癌早期診斷及 預后預測試劑盒的應用。
【專利摘要】一種檢測肝癌標志物IMP1抗原表位的氨基酸序列及應用，屬于免疫學技術領域，本發明提供了一種肝癌相關基因IMP1的抗原氨基酸序列。應用IMP1多肽抗原檢測肝癌患者血中相應的特異性自身抗體，這種自身抗體可作為肝癌標志物評估肝癌發生的危險度及預后療效。這種抗原多肽及其抗體可用于制備肝癌早期診斷、預后預測試劑和開發治療肝癌的靶向藥物。
【IPC分類】G01N33/574, C07K14/47
【公開號】CN105111297
【申請號】CN201510502158
【發明人】孫世龍, 劉穎
【申請人】孫世龍
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2015年8月17日