一種玉米品種東單60純度檢測的ssr分子標記試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種分子標記檢測試劑盒，特別是涉及一種玉米品種東單60純度檢 測的SSR分子標記試劑盒。
【背景技術】
[0002] 玉米是我國的重要作物，在農業生產中占有重要地位。玉米種子質量直接影響產 量，玉米種子純度是評價種子質量的重要指標。實踐中，我國玉米種子純度鑒定仍以籽粒形 態鑒定、幼苗鑒定和田間小區種植鑒定為主體，輔以同工酶和蛋白質電泳技術。
[0003] 利用種子、幼苗或者株型等形態差異鑒定純度的方法費時費力、受環境和基因顯 隱性等的影響較大，檢測結果易出現偏差。同工酶和蛋白質電泳技術具有簡單、快速、成本 低等優點，然而，而且隨著玉米品種的數量逐年增多，種質資源狹窄，同質化問題愈顯突出， 難以找到雜交種特征帶，難以進行有效的品種純度檢測。
[0004] 利用SSR分子標記技術對玉米品種純度鑒定的優越性在于：（I)SSR分子標記數量 大，特異性高，可鑒定表型難于鑒別的品種；（2)SSR分子標記不受任何環境因素的影響，可 在生長發育的任何階段取材鑒定；（3)SSR分子標記呈共顯性遺傳，操作靈活、簡便、快速， 易于分析；（4)利用SSR分子標記鑒定品種，不僅準確可靠，而且還便于實現標準化。
[0005] 玉米品種東單60是遼寧東亞種子科學研究院于2001年遼寧省審定的品種，遼審 玉[2001] 132號，以A801為母本，以ClOl為父本組配而成的。株高290厘米，穗位128厘 米，穗長19. 8厘米，株型較緊湊，籽粒黃色，馬齒型。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，用 以檢測玉米品種東單60的純度，本試劑盒具有快速、準確、簡便等優點，可以及時準確的檢 測出純度結果，能夠減少假劣種子坑農害農案件的發生，保證糧食種植安全。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的： 一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，以玉米品種東單60及父母本 雙親的基因組DNA為模板，通過對覆蓋全基因組200對SSR引物進行篩選，獲得兩對雙親互 補特異性高、重復性好、結果穩定的SSR引物，SEQIDNO:1和2和SEQIDNO:3和4。
[0008]SEQIDNO:1 序列（5, 一 3'）GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG SEQIDNO:2 序列（5, 一 3'）CACGTACGGCAATGCAGACAAG SEQIDNO:3 序列（5, - 3,）GATCCGCATTGTCAAATGACCAC SEQIDNO:4 序列（5, 一 3'）AGGACACGCCATCGTCATCA 所述的一種玉米品種東單60純度檢測SSR分子標記試劑盒，以玉米品種東單60的基 因組DNA為模板，以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4為SSR特異性引物，進行PCR 擴增。
[0009] 所述的一種玉米品種東單60純度檢測SSR分子標記試劑盒，PCR反應體系總體積 201^，包括14.11^超純水、21^10倍卩〇?緩沖液、1.21^(1犯1^(2.5臟〇1/1)、0.51^ 35尺引物（0.254111〇1/1)、0.21^71叫0嫩聚合酶（2.51]/1^)、21^0嫩，混勻。
[0010] 所述的一種玉米品種東單60純度檢測SSR分子標記試劑盒，反應程序為94°C預變 性 5min;94°C變性 40s，60°C退火 35s，72°C延伸 45s，循環 35 次；72°C延伸 5min;4°C保存。
[0011] 所述的一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，純度結果通過帶型 統計，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子粒數的百分率表示。
[0012] 試劑盒中還可包括抽提樣品DNA所需的各種試劑。這些試劑是本領域技術人員周 知的。
[0013] 本發明的優點與效果是： 1.本發明在對覆蓋玉米全基因組的200對SSR引物進行篩選，獲得兩對雙親互補特異 性高、重復性好、結果穩定的SSR引物，由其兩對特異性引物和7?濟每等試劑開發出針對玉 米品種東單60純度檢測的試劑盒，可以快速、準確、簡便的檢測出玉米品種東單60的純度， 為品種管理和市場監管提供技術支撐，還對保證糧食種植安全具有一定的指導意義。
[0014] 2.本發明的試劑盒具有快速、準確、簡便等優點，可以及時準確的檢測出純度結 果，能夠減少假劣種子坑農害農案件的發生，保證糧食種植安全。
[0015] 3.本發明的試劑盒可為品種管理和市場監管提供技術支撐。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明的SEQIDNO:1和2擴增玉米品種東單60及父母本結果圖； 圖2為本發明的SEQIDNO:3和4擴增玉米品種東單60及父母本結果圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合實施例對本發明進行詳細說明。
[0018] 本發明的檢測過程為： (1)玉米品種東單60基因組DNA提取隨機數取100粒種子，采取CTAB法進行DAN提 取。
[0019] (2)PCR擴增以SEQIDNO:1和2或SEQIDNO:3和4為SSR特異性引物，配制 20ulPCR反應體系。
[0020] (3)PCR反應體系總體積20yL，包括14.IyL超純水、2yL10倍PCR緩沖液、 1.21^(1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?特異性引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混勻。
[0021] (4)反應程序為94°C預變性5min;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 環35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0022] (5)電泳檢測對PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0023] (6)純度結果通過帶型統計，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子 粒數的百分率表示。
[0024] 實施例1 本實施例中用玉米品種東單60純度檢測SSR分子標記試劑盒，檢測玉米品種東單60 樣品A的純度。操作流程如下： 1)隨機數取玉米品種東單60樣品AlOO粒種子，采取CTAB法進行DAN提取。
[0025] (2)PCR擴增以SEQIDNO:1和2為SSR特異性引物，配制20ulPCR反應體系。
[0026] (3)PCR反應體系總體積20yL，包括14.IyL超純水、2yL10倍PCR緩沖液、 1.21^(1犯138(2.5臟〇1/1)、0.51^551?特異性引物（0.254111〇1/1)、0.21^7 1叫0嫩聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混勻。
[0027] (4)反應程序為94°C預變性5min;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 環35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0028] (5)電泳檢測對PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0029] (6)純度結果通過帶型統計，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子 粒數的百分率表示。
[0030] 具有本品種特異帶型的種子粒數為93,按公式：
玉米品種東單60樣品A純度為=93/100=93%。
[0031] 實施例2 本實施例中用玉米品種東單60純度檢測SSR分子標記試劑盒，檢測玉米品種東單60 樣品B的純度。操作流程如下： 1)隨機數取玉米品種東單60樣品BlOO粒種子，采取CTAB法進行DAN提取。
[0032] (2)PCR擴增以SEQIDNO:3和4為SSR特異性引物，配制20ulPCR反應體系。
[0033] (3)PCR反應體系總體積20yL，包括14.IyL超純水、2yL10倍PCR緩沖液、 1.21^(1贈8(2.5臟〇1/1)、0.5卩1^51?特異性引物（0.25卩111〇1/1)、0.2卩1^&9 0熟聚合 酶（2. 5U/yL)、2yLDNA，混勻。
[0034] (4)反應程序為94°C預變性5min;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循 環35次；72°C延伸5min;4°C保存。
[0035] (5)電泳檢測對PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。
[0036] (6)純度結果通過帶型統計，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子 粒數的百分率表示。
[0037] 具有本品種特異帶型的種子粒數為96,按公式：
【主權項】
1. 一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含 有2對雙親互補特異性高、重復性好、結果穩定的SSR引物：SEQ ID NO :1和2和SEQ ID NO: 3 和 4 ;； SEQ ID NO :1 序列（5, 一 3'）GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG ; SEQ ID NO :2 序列（5, 一 3'）CACGTACGGCAATGCAGACAAG ; SEQ ID NO :3 序列（5, - 3'）GATCCGCATTGTCAAATGACCAC ; SEQ ID NO :4 序列（5, 一 3'）AGGACACGCCATCGTCATCA。2. 根據權利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，其特 征在于，以玉米品種東單60的基因組DNA為模板，以SEQ ID NO :1和2或SEQ ID NO :3和 4為SSR特異性引物，進行PCR擴增。3. 根據權利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，其特 征在于，PCR反應體系總體積20 y L，包括14. I y L超純水、2 y L 10倍PCR緩沖液、I. 2 y L dNTPs(2. 5mmol/L)、0. 5 y L SSR 引物（0? 25 ymol/L)、0. 2 y L DNA 聚合酶（2. 5U/y L)、 2yL DNA，混勻。4. 根據權利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，其特 征在于，反應程序為94°C預變性5min ;94°C變性40s，60°C退火35s，72°C延伸45s，循環35 次；72°C延伸5min ;4°C保存。5. 根據權利要求1所述的一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，其特 征在于，純度結果通過帶型統計，用具有本品種特異帶型的種子粒數占檢測樣品種子粒數 的百分率表示。
【專利摘要】一種玉米品種東單60純度檢測的SSR分子標記試劑盒，涉及一種分子標記檢測試劑盒，本發明利用父母本雙親互補特異性SSR引物對玉米品種東單60進行純度檢測。以玉米品種東單60及父母本雙親的基因組DNA為模板，通過對覆蓋全基因組200對SSR引物進行篩選，獲得兩對雙親互補特異性高、重復性好、結果穩定的SSR引物，由其兩對特異性引物和<i>Taq</i>酶等試劑開發出針對玉米品種東單60純度檢測的試劑盒。該試劑盒的開發，不僅可以快速評價玉米純度質量，為品種管理和市場監管提供技術支撐，還對提高種子產業整體質量水平，保證糧食種植安全具有一定的指導意義。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105087784
【申請號】CN201510449540
【發明人】岳靜, 朱志成, 楊雙
【申請人】沈陽化工大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年7月28日