干擾豬PACAP基因表達的siRNA、載體及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種干擾豬PACAP基因表達的SiRNA及其shRNA，以及利用該ShRNA構 建的慢病毒介導的豬PACAP基因干擾載體及應用。 (二）
【背景技術】
[0002] 慢病毒載體是一類逆轉錄病毒載體，以其轉染效率高，可感染分裂期和非分裂期 細胞，可容納較大的基因片段等優點，現已被作為轉移目的基因的理想載體。而RNA干擾 技術是近年來迅速發展起來可以特異性地剔除特定基因或者抑制特定基因表達的一種新 技術，在病毒感染、心血管疾病、腫瘤等疾病的治療中被廣泛應用。慢病毒載體介導的RNA 干擾，是將慢病毒載體高效感染的特性與RNA干擾特異性抑制同源基因表達的作用結合起 來，有望為特定基因的功能以及相關疾病的治療研究提供新的手段和方法。
[0003] 垂體腺苷酸環化酶激活肽（PACAP)由下丘腦合成并分泌，具有多種生理功能，其 中刺激生長激素（GH)的釋放是其重要功能之一。利用慢病毒介導的豬PACAP基因RNA干 擾載體，能夠顯著降低PACAP基因在細胞內的表達，為研究豬GH調控、轉基因高瘦肉率豬提 供了研究基礎。 (三）
【發明內容】
[0004] 本發明目的是提供一種干擾豬PACAP基因表達的SiRNA及其ShRNA，以及利用該 shRNA構建的慢病毒介導的豬PACAP基因干擾載體及應用。
[0005] 本發明采用的技術方案是：
[0006] 干擾豬PACAP基因表達的siRNA，其序列如SEQIDNo. 1所示： 5' -GCTACAGCCGCTATCGGAAACAAAT-3'。該干擾序列為人工設計，能夠有效的降低目的細胞 PACAP基因和蛋白的表達，熒光定量PCR結果顯示PACAP基因的表達量下降了 90 %，Western blot結果顯示PACAP蛋白表達量下降了 88%。
[0007]干擾豬PACAP基因表達的shRNA，其序列如SEQ ID No. 2所示：5'-GATCGCTACAGCCG CTATCGGAAACAAAITTCAAGAGAAITTGITTCCGATAGCGGCTGTAGCTmTTC-3'。由于直接導入外源的 siRNA的話其作用時間有限（一般只有幾天），需要穩定表達的siRNA就有了shRNA，shRNA 是在設計的兩段siRNA兩邊加上一段序列、中間加上一段loop序列以后形成的，可以連接 到載體上、并通過載體能進入細胞中穩定表達的形式。
[0008] 本發明還涉及利用所述ShRNA構建的慢病毒介導的豬PACAP基因干擾載體，由所 述shRNA插入pLV-U6_Zsgreen載體中獲得，所述pLV-U6_Zsgreen載體質粒圖譜如圖1所 示，其中U6啟動子后為MCS區，目的片斷shRNA插入BamHI，EcoRI位點。
[0009] 本發明還涉及所述SiRNA在豬生長激素調控中的應用。
[0010]本發明還涉及所述siRNA在培育轉基因高瘦肉率豬中的應用。
[0011] 本發明的有益效果主要體現在：本發明設計的siRNA能夠有效降低PACAP基因和 蛋白的表達，利用其shRNA構建的慢病毒介導的豬PACAP基因RNA干擾載體，能夠顯著降低 PACAP基因在細胞內的表達，為研究豬GH調控、轉基因高瘦肉率豬提供了研究基礎。 (四）
【附圖說明】
[0012] 圖1為pLV-U6_Zsgreen干擾載體質粒圖譜；
[0013]圖 2 為PACAPshRNAl測序結果；
[0014]圖 3 為PACAPshRNA2 測序結果；
[0015]圖 4 為PACAPshRNA3 測序結果；
[0016] 圖5為有限稀釋法測定慢病毒滴度圖；
[0017] 圖6為熒光定量PCR結果；
[0018]圖 7、圖 8 為WesternBlotting結果。 (五）
【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0020] 實施例I:PACAPshRNA慢病毒載體構建
[0021] 1.1實驗材料
[0022] (一）載體及目的基因信息：
[0023]I)pLV-Ue-Zsgreen干擾載體（保存于浙江大學動物遺傳育種與繁殖實驗室）圖譜 如圖1，U6啟動子后為MCS(多克隆位點）區，BamHI和EcoRI為插入位點：
[0024] 2)目的片斷插入BamHI，EcoRI位點，由U6啟動子調控表達，該慢病毒載體中含有 CMV啟動子調控的Zsgreen標記。
[0025] 3)干擾序列設計如下：
[0026]PACAPsiRNAl 序列：GCTGGTCTACGGGATAATAAT
[0027]PACAPshRNAl 序列：
[0030]PACAPsiRNA2 序列：GCTACAGCCGCTATCGGAAACAAAT
[0031]PACAPshRNA2 序列：
[0032]
[0036] I. 2實驗流程
[0037] PACAP shRNA的構建
[0038] 1.2. 1引物合成
[0039] L 2. 2載體pLV-U6-Zsgreen用BamHI，EcoRI雙酶切，酶切體系如下：
[0040]
[0041] 1.2. 3酶切完成后膠回收
[0042] L 2. 4目的片斷shRNA利用3'和5'的單鏈退火獲得：
[0043]體系：20ul
[0044] IOXBuffer：2ul
[0045] IOOmM Tris-cl pH7. 5
[0046] IM NaCl
[0047] IOmM EDTA
[0048] shDNA-R/shDNA-F：l/lul
[0049] H2O：16ul
[0050] 退火程序：
[0063] 實施例2:慢病毒包裝
[0064] 1、實驗流程
[0065]制備慢病毒穿梭質粒及其輔助包裝原件載體質粒，三種質粒載體分別進行高純度 無內毒素抽提，共轉染293T細胞，轉染后6h更換為完全培養基，培養48h和72h后，收集富 含慢病毒顆粒的細胞上清液，〇. 45um濾器（Millpore公司）過濾病毒上清液，病毒上清液通 過超離心濃縮病毒。對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。
[0066] 2、實驗材料
[0067] 慢病毒載體、包裝細胞和菌株
[0068] 該病毒包裝系統為三質粒系統，組成為pSPAX2,pMD2G，pLV-U6-Zsgreen。
[0069] 293T生長培養基為DMEM(含 10 %FBS)。
[0070] 菌株為感受態細胞：DH5a
[0071] 3、具體步驟
[0072] 3. 1質粒擴增
[0073] 構建好的慢病毒載體和輔助質粒需經過大量抽提，濃度大于lug/ul，A260/280在 1.7~1.8間方可用以包毒。
[0074] 3. 2 傳 293T細胞
[0075] 將培養2931'細胞了75瓶中的培養基吸凈，加入21^4度冰箱取出的0.25%胰酶， 使其均勻覆蓋瓶底，置于37度培養箱中3-5min，取出，搖晃可發現細胞于底部脫離，將其全 部晃下，加入3mL37度水浴中預熱的10%DMEM，移液槍用IOmL移液管進行吹打，較大力吹 打6-8次即可，不留死角，瓶口處較難吹打可將移液管對準培口，小力將培養基打出即可覆 蓋到接近瓶口的細胞。之后，將所有細胞吸出，置于15mL離心管中，取50ul混勻后的細胞 于1.5mL印pendorf管中，加入450ul10%DMEM，即為10倍稀釋，混勻，取IOul細胞于計 數板中計數。計數板上共4大格，每大格16小格。計數時，4大格均計數，總數除以4 (得每 大格細胞數），再乘以10 (10倍稀釋），即為實際n萬/mL細胞濃度。傳代當天記為第一天， 若第二天進行轉染，鋪900-1000萬/T75;若第三天轉染，鋪350-400萬/T75。每瓶T75加 IOmL10%DMEM培養基。轉染當天觀察細胞密度，80-90%滿即可進行轉染。轉染前無需換 培養基。
[0076] 3. 3做脂轉complex
[0077] OptiMEM需在37度水浴中預熱，轉染試劑恢復至室溫使用，使用前需搖勻。
[0078] 轉染每瓶T75的complex成分如下：
[0079] pSPAX2 IOyg
[0080]pMD2G10 y g
[0081]pLV載體 IOyg
[0082] 轉染后6h換新鮮培液。
[0083] 3. 4病毒收集
[0084] 轉染后48和72h分別兩次收集病毒上清（24h收集后置換新鮮培液），收集后以 0. 45ym濾器過濾，于40mL超速離心管中，4°C，72000g/min離心120分鐘；
[0085] 3. 5病毒重懸和保存
[0086] 500ul新鮮培養液重懸病毒沉淀，置于-80度保存。
[0087] 3. 6滴度測定（稀釋計數法）：
[0088]I?細胞準備
[0089] 將生長狀態良好的293T細胞消化計數后稀釋至IxioVml,加入96孔板，IOOul/ 孔，為每個病毒準備6個孔。放入37"€，5%(1)2培養箱中培養。
[0090]II.加病毒
[0091]第二天，在EP管中做3倍梯度稀釋，連續6個稀釋度。稀釋方法如下：
[0092] 1)每種病毒準備6個I. 5mlEP管，第一管加入105ul培養液以及15ul病毒原液；
[0093] 2)混勻后從第一個管吸取40ul加入第二個管（含有SOul培養液）；
[0094] 3)混勻后從第二個管吸取40ul加入第三個管（含有80ul培養液）；
[0095]4)以此類推，做6個稀釋度（10~3. 3*10~ 2)，稀釋好后將每管液體加入對應的96 孔中。
[0096]III.觀察結果并計算滴度
[0097] 第五天，在熒光顯微鏡下觀察結果，熒光百分比在10~30%的孔計算病毒滴度： 滴度（PFU/ml)=細胞數*熒光百分比*M0I(1)*病毒稀釋倍數*10~3。滴度結果圖見圖5。
[0098] 滴度結果：Lv-PACAPshl, 2, 3滴度均為I X 10sPFU/ml，對照組病毒滴度為 2X 10sPFU/ml。說明經慢病毒包裝的病毒滴度較高，可用于后續感染目的細胞。
[0099] 3. 7慢病毒感染目的細胞：
[0100] 方法：轉染前24h，將目的細胞（大白豬胎兒成纖維細胞）以IO5Ail密度接種于12 孔板中，使細胞密度達到60%~70%時進行轉染。以每孔500ul培養液和細胞的MOI值配 制病毒轉染體系（每孔IOOul病毒液），吸去原有培養基，每孔加入新鮮配制的混合液，于 37°C，5%CO2培養箱中繼續培養，轉染48h后觀察細胞生長狀態和綠色熒光表達情況。
[0101] 結果：設計的三條干擾序列中，PACAPshRNAl和shRNA3雖然能使PACAP基因和蛋 白表達量下降，但是干擾效果不明顯。PACAP shRNA2能夠有效的降低目的細胞PACAP基因 和蛋白的表達，熒光定量PCR結果（圖6)顯示PACAP shRNA2干擾序列能使PACAP基因的 表達量下降了90% ,Western blot結果（圖7、8)顯示PACAP shRNA2感染序列使PACAP蛋 白表達量下降了88%，因此利用其構建的慢病毒介導的豬PACAP基因RNA干擾載體，能夠顯 著降低PACAP基因在細胞內的表達，為研究豬GH調控、轉基因高瘦肉率豬提供了研究基礎。
【主權項】
1. 一種干擾豬PACAP基因表達的siRNA，其序列如SEQ ID No. 1所示。2. -種干擾豬PACAP基因表達的shRNA，其序列如SEQ ID No. 2所示。3. 利用權利要求2所述shRNA構建的慢病毒介導的豬PACAP基因干擾載體，由所述 shRNA插入pLV-U6_Zsgreen干擾載體中獲得，所述pLV-U6_Zsgreen干擾載體質粒圖譜如圖 1所示，其中U6啟動子后為MCS區，目的片斷shRNA插入BamHI，EcoRI位點。4. 權利要求1所述SiRNA在豬生長激素調控中的應用。5. 權利要求1所述siRNA在培育轉基因高瘦肉率豬中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種干擾豬PACAP基因表達的siRNA及其shRNA，以及利用該shRNA構建的慢病毒介導的豬PACAP基因干擾載體及應用。所屬干擾豬PACAP基因表達的siRNA和shRNA，其序列分別如SEQ？ID？No.1和2所示。本發明設計的siRNA能夠有效降低PACAP基因和蛋白的表達，利用其shRNA構建的慢病毒介導的豬PACAP基因RNA干擾載體，能夠顯著降低PACAP基因在細胞內的表達，為研究豬GH調控、轉基因高瘦肉率豬提供了研究基礎。
【IPC分類】A01K67/027, C12N15/113, C12N15/867
【公開號】CN105087583
【申請號】CN201510481926
【發明人】毛海光, 徐寧迎, 王爭光
【申請人】浙江大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月7日