藜麥est-ssr分子標記及其開發方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子標記技術領域，具體涉及藜麥EST-SSR分子標記及其開發方法與 應用。
【背景技術】
[0002] SSR(simplesequencerepeat)又稱為微衛星DNA，由2個~6個喊基的單元序 列串聯重復而成，具有多態性高、共顯性、數量豐富等特點，廣泛用于遺傳圖譜構建、遺傳多 樣性分析等。早期發展SSR標記的方法通常采用構建文庫的方式進行，包括基因組文庫和 cDNA文庫。通常基于EST(expressedsequencetag)發展的SSR稱為EST-SSR，與通過基 因組序列發展的基因組SSR相比，EST-SSR因其兩端側翼序列的保守性較強，在不同物種間 具有良好的通用性。近年來，利用公共數據庫中豐富的基因組序列以及表達序列信息發展 分子標記成為分子標記開發的重要途徑。
[0003] 藜麥（ChenopodiumquinoaWilld.)，原產于南美安第斯地區，是一種一年生藜科 雙子葉草本產種植物，具有出色的耐干旱、耐鹽堿的特性，是唯一一種被聯合國糧農組織認 可的單體即可滿足人體基本營養需求的植物。據報道，藜麥基因組大小約為967M，為異源四 倍體物種（2n= 4x= 36)，基因組序列組裝困難，至今尚無基因組測序相關報道，因此，很 難大規模開發分子標記。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)是首先報道的基于 藜麥DNA的分子標記。此類分子標記可用于藜麥種間雜交種的鑒定以及藜麥和其它藜科物 種的遺傳變異分析。隨后，通過對富含微衛星基元的克隆進行測序，Masonetal.開發并 驗證了 208個在藜麥種間具有較高多態性的共顯性SSR分子標記。研究表明，相比于二核 苷酸重復的SSR分子標記，三核苷酸重復的SSR(>20bp)具有更高的多態性。借助富含 GA，CAA和AAT重復的文庫以及BES(bacterialartificialchromosome-endsequence)， Jarvisetal.開發了 216 個新型多態性SSR以及 6 個BES-SSR，多態性PIC(polymorphism informationcontent)介于0. 12~0. 90之間，并構建了藜麥首個基于SSR標記的遺傳連 鎖圖譜。該遺傳連鎖圖譜包含200個SSR，由38個連鎖群組成，覆蓋了藜麥913cM的遺傳距 離。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對目前藜麥分子標記數量較少的不足，利用公共數據庫中藜麥 表達序列數據，通過生物信息學手段大規模挖掘藜麥EST-SSR，對部分藜麥EST-SSR進行了 驗證及多態性分析，并利用開發的EST-SSR對藜科種質的遺傳多樣性進行了評價。
[0005] 為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一組藜麥EST-SSR分子標記，其特 征在于：包括有如下66個位點所對應的正向和反向引物：
[0006]
[0010] 本發明所述的藜麥EST-SSR分子標記的開發方法，包括以下步驟：
[0011] 1)從NCBI數據庫獲取RNA-seq及EST序列；
[0012] 2)利用生物信息學軟件對序列進行處理、組裝、拼接成unigene，并對unigene進 行SSR位點搜索從而獲取EST-SSR;
[0013] 3)設計EST-SSR引物擴增藜麥基因組DNA，并對EST-SSR進行驗證；
[0014] 進一步的，在所述步驟3)中，EST-SSR引物設計采用如下參數設置：Tm為 58°C±3°C，引物長度為20bp±3bp，產物預期長度為IOObp~450bp。
[0015] 進一步的，所述步驟3)中PCR擴增程序為94°C3min;94°C30s，58°C35s， 72°C50s，38 個循環；72°C3min。
[0016] 進一步的，所述步驟3)中PCR擴增體系為25y1，含有2mmol/LMgCl2,100ymol/ LdNTP，0. 2ymol/L引物，IUTaq酶及 50ngDNA。
[0017] 本發明所述的藜麥EST-SSR分子標記在藜科種質遺傳多樣性分析中的應用。
[0018] 進一步的，所述藜科種質是指包括藜麥在內的藜科植物。
[0019] 本發明的有益效果：
[0020] 1、本發明基于公共數據庫開發的EST-SSR分子標記具有高效性。本發明根據獲取 的14.OG藜麥RNA-Seq數據以及EST數據拼接得到19, 571條unigene。其中，16, 854條 序列含有20, 338SSR位點，包含1，862個非單核苷酸重復SSR(二、三、四、五、六核苷酸重 復）。
[0021] 2、本發明開發的EST-SSR成功率高、多態性豐富。隨機選取119對EST-SSR引物 對藜麥DNA以及其它藜科種質DNA中進行擴增。結果顯示，共有66對能夠在藜麥DNA擴增 中獲得清晰的擴增條帶，成功率55. 9%。66對引物中，58對引物在10%的聚丙烯酰胺凝膠 上能夠擴增出兩種以上類型的條帶，其中5對引物能夠擴增出最多的4種類型條帶，平均每 對引物能擴增出2. 2種條帶。通過PIC計算，61個為多態性EST-SSR(PIC彡0. 10)，占總數 的 92. 4% 〇
[0022] 3、本發明開發的EST-SSR通用性較強。本發明收集了 8份來源不同的藜科種質，包 括4份藜麥，2份蒼白莖藜，1份臺灣藜和1份杖藜，分別來自于四個大洲的5個國家地區。 66對EST-SSR引物在8份藜科種質DNA中均能擴增出多種類型的條帶，顯示了良好的通用 性。
【附圖說明】
[0023] 圖1為基于相似性系數構建的8份藜科種質的UPGMA樹狀圖。
【具體實施方式】
[0024] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。
[0025] 1)藜麥表達序列數據的獲取及unigene的拼接。從NCBI的SRA數據庫（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)共獲取 11. 9GIlluminaHiSeq2000 的RNA-Seq數據（登錄 號：SRX257003 和SRX256971)以及 2.IGRoche454 的EST數據（登錄號：SRX084791)。經 過對原始數據進行轉換、清理、過濾，利用Trinity軟件拼接得到19, 571條unigene，總堿基 數為80, 448, 006bp，平均每條unigene長約4kb。其中16, 854條序列含有SSR位點。
[0026] 2)藜麥EST-SSR位點的鑒定。通過MISA軟件（http://pgrc.ipk-gatersleben. de/misa/)對unigene序列進行SSR位點識別，SSR位點的識別條件為：單核苷酸重復不低 于10次，二核苷酸重復不低于8次，三核苷酸重復不低于7次，四核苷酸重復不低于5次， 五核苷酸及六核苷酸重復不低于4次；復合SSR的識別條件是2個SSR之間的距離不超過 50bp。結果發現藜麥EST-SSR重復類型豐富，從單核苷酸重復到六核苷酸重復均有出現。 非單核苷酸重復有1，862個。其中，二核苷酸重復SSR最多，占非單核苷酸重復SSR總數的 38. 3% (713個），其次為三核苷酸重復，占非單核苷酸重復SSR總數的22. 7% (423個），最 少的為六核苷酸重復，占非單核苷酸重復SSR總數的11. 7% (217個）。
[0027] 3)藜麥EST-SSR的引物設計。利用Primer3. 0軟件對側翼序列大于200bp且重 復長度大于16bp的非單核苷酸重復SSR位點進行引物設計，引物設計采用如下參數設置： Tm為58°C±3°C，引物長度為20bp±3bp，產物預期長度為IOObp~450bp，其它參數設為默 認。共有119個EST-SSR設計了引物對。
[0028] 4)藜麥EST-SSR的驗證及多態性分析。利用KarrotenDNA提取試劑盒對試驗材 料的幼苗進行DNA提取。經過1%瓊脂糖凝膠檢測的DNA用于PCR擴增。PCR反應總體系 為25以1，含有2臟〇1/1]\%(：12，10(^111〇1/1(1犯1 3,0.2 4111〇1/1引物，11]139酶及501^0熟。 ?〇?反應程序為：94￡€31^11;94 1€308,581€358,721€508,38個循環；721€3111111。？〇?擴增 產物在10 %聚丙烯酰胺凝膠上以IOOV電壓電泳120min，EB染色后在紫外透射儀上觀察結
個等位基因的頻率，k為等位基因的數量。PIC彡0. 10為多態性SSR，PIC彡0. 70為高多 態性SSR。共有119對EST-SSR引物對8份藜科種質DNA進行擴增（見表1)，66對引物在 10%的聚丙烯酰胺凝膠上能夠獲得清晰的擴增條帶，成功率55. 9% (見表2)。其中，六核 苷酸重復SSR的成功率最高，為74. 3%，五核苷酸重復SSR的成功率最低，為31. 8%。66對 引物共擴增出145種條帶，平均每對引物能擴增出2.2種條帶。通過PIC計算，61個為多態 性EST-SSR(PIC彡 0? 10)，占總數的 92. 4%。
[0029] 表1 8份供試材料
[0035] 5)藜麥EST-SSR分子標記在藜科種質遺傳多樣性分析中的應用66個EST-SSR 分子標記用于8份藜科種質的基因型分析。聚類分析采用NTSYSpc2.1軟件，該分析基于 UPGMA法（unweightedpairgroupmethodanalysis)計算遺傳相似性。選取根據UPGMA聚類結果，來自南美的四份藜科種質被聚成一類，包括三份藜麥和一份蒼白莖藜；來自北美 的杖藜、歐洲的藜麥以及中國的臺灣藜被明顯的分開，各自分成三類；來自南美的另一份蒼 白莖藜并沒有與南美的其它四份藜科種質分成一類，提示該份蒼白莖藜與其它來自同一區 域的四份藜科種質親緣關系較遠（見圖1)。該結果表明EST-SSR能夠將藜科種質按照區域 分開，展示了藜麥EST-SSR在不同藜科物種間良好的通用性。
【主權項】
1. 一組藜麥EST-SSR分子標記，其特征在于：包括有如下66個位點所對應的正向和反 向引物：2. 根據權利要求1所述藜麥EST-SSR分子標記的開發方法，其特征在于：該方法包括 以下步驟： 1) 從NCBI數據庫獲取RNA-seq及EST序列； 2)利用生物信息學軟件對序列進行處理、組裝、拼接成unigene，并對unigene進行SSR 位點搜索從而獲取EST-SSR ; 3) 設計EST-SSR引物對藜麥基因組DNA進行PCR擴增，并對EST-SSR進行驗證。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：在所述步驟3)中，EST-SSR引物設計采用 如下參數設置：Tm為58°C±3°C，引物長度為20bp±3bp，產物預期長度為lOObp~450bp。4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中PCR擴增程序為 94°C3min;94°C30s, 58°C35s, 72°C50s, 38 個循環；72°C3min。5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟3)中PCR擴增體系為25y1，含 有 2mmol/LMgCl2，100ymol/LdNTP，0.2ymol/L引物，1UTaq酶及 50ngDNA。6. 權利要求1所述藜麥EST-SSR分子標記在藜科種質遺傳多樣性分析中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述藜科種質是指包括藜麥在內的藜科 植物。
【專利摘要】本發明涉及分子標記技術領域，具體涉及藜麥EST-SSR分子標記及其開發方法與應用。一組藜麥EST-SSR分子標記包括66個位點所對應的正向和反向引物，其開發方法包括步驟：1)從NCBI數據庫獲得RNA-seq及EST序列；2)利用生物信息學軟件對序列進行處理、組裝、拼接成unigene，并對unigene進行SSR位點搜索獲取EST-SSR；3)設計EST-SSR引物擴增藜麥基因組DNA對EST-SSR進行驗證，利用驗證的EST-SSR分子標記在藜科種質中進行遺傳多樣性分析的應用。本發明基于公共數據庫開發的EST-SSR分子標記具有高效性,成功率高、多態性豐富,且通用性較強。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105087574
【申請號】CN201510595296
【發明人】張體付, 趙涵, 戚維聰
【申請人】江蘇省農業科學院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月17日