用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，該染色法由丹麥醫(yī)師Gram于1884年創(chuàng)立，通過該方法可以將細(xì)菌分為革蘭氏陽性菌和陰性菌。
[0003]革蘭氏染色法的主要步驟包括結(jié)晶紫染色、碘液復(fù)染、酒精脫色和番紅復(fù)染四步，染色結(jié)果的差異主要是由于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的差異所引起的。陽性菌細(xì)胞壁較厚，肽聚糖網(wǎng)層次較多且交聯(lián)致密，導(dǎo)致結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物難以透過細(xì)胞壁而使細(xì)胞呈紫色；而陰性菌細(xì)胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯(lián)度差，經(jīng)酒精脫色后，結(jié)晶紫與碘復(fù)合物易溶出，經(jīng)過番紅復(fù)染后細(xì)胞最終呈紅色。
[0004]革蘭氏染色技術(shù)是高校生物相關(guān)專業(yè)學(xué)生必須掌握的一種操作技術(shù)，但操作比較復(fù)雜，對各步驟要求比較嚴(yán)格，若操作不當(dāng)很容易造成相反的結(jié)果。另外，該染色法要求用于染色的菌劑處在對數(shù)生長期，菌劑過老易造成假陰性結(jié)果。但目前尚沒有商品化的菌劑直接用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)，以致每次上課前兩三天，教師必須先經(jīng)過培養(yǎng)基配制、菌種活化和菌種培養(yǎng)等步驟，進(jìn)行菌劑準(zhǔn)備，既費(fèi)時間又費(fèi)力氣。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是:提供一種用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，應(yīng)用該方法制備的菌劑使學(xué)生簡單直觀的判斷細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果的好壞，既利于學(xué)生自我判斷操作技術(shù)掌握程度，又能降低教師上課之前進(jìn)行實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的工作量。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:該用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑由大腸桿菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合而成，該菌劑的制備方法包括如下步驟:
(1)菌種活化:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌試管斜面從冰箱中取出，將其分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；
(2)種子培養(yǎng):將活化過的菌種單菌落分別接種于含5mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，在37°C恒溫振蕩器中培養(yǎng)過夜；
(3)搖瓶培養(yǎng):將培養(yǎng)好的兩菌株液體種子各接種到含LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，恒溫振蕩器中培養(yǎng)；
(4)菌劑制備:按比例取培養(yǎng)好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液加入到同一5ml離心管中離心，然后倒掉上清液，并將離心管倒置于濾紙上，充分吸掉液體；
(5)菌劑保藏:將含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的固體混合菌劑的離心管置于冰箱中保藏，保藏3-10天。
[0007]其中，步驟(I)中所用的菌為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。
[0008]其中，步驟(2)中細(xì)菌種子在含5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)。
[0009]其中，步驟(3)中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的液體種子按5-10%的體積比例接種，250mL三角瓶中含有40-60mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、150_200rpm。
[0010]其中，步驟(4)中培養(yǎng)好的菌為處在對數(shù)生長期中期。
[0011]其中，步驟(4)中加入離心管待離心的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的體積比例為1:3-3:1。
[0012]其中，步驟(4)中離心條件為4°C、5000_7000rpm離心5-lOmin。
[0013]其中，步驟(5)中菌劑的保存方法為離心后的菌劑連同離心管共同保存于4°C冰箱。
[0014]使用時，按人數(shù)的多少，取出適量離心管分配給學(xué)生，每管供5-10個學(xué)生進(jìn)行革蘭氏染色練習(xí)，取出的試管不能再放入冰箱供下次使用。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:(I)所用菌為呈革蘭氏陰性的大腸桿菌和陽性的金黃色葡萄球菌，其細(xì)胞形態(tài)分別為桿狀和球狀，在學(xué)生進(jìn)行革蘭氏染色練習(xí)的過程中可以非常直觀的判斷自己染色結(jié)果的對錯，從而判斷自身染色技能的優(yōu)劣；(2)本菌劑制備簡單，且在4°C冰箱中保藏3-10天，不會對染色結(jié)果產(chǎn)生影響，一次制備供大量學(xué)生多次使用，從而減輕了教師實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的工作量，提高了工作效率。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實(shí)施例不能理解為是對技術(shù)方案的限制。
[0017]實(shí)施例1:依以下步驟制備用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑
(1)菌種活化:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌試管斜面從冰箱中取出，分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，直至長出單菌落；
(2)種子培養(yǎng):從活化過的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平板上挑取單菌落，各接種于含5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，在恒溫振蕩器中于37°C、150rpm的條件下培養(yǎng)過夜；
(3)搖瓶培養(yǎng):將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的液體種子按5%的體積比例各接種到含有40 mL LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在恒溫振蕩器中37°C、150rpm的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；
(4)菌劑制備:按1:3的體積比例取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液加入到同一 5ml離心管中，在4°C離心機(jī)中以每分鐘6000rpm的速度離心8min，倒掉上清液，然后將離心管倒置于濾紙上充分吸掉液體；
(5)菌劑保藏:將含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌固體混合菌劑的離心管置于4°C冰箱中保藏，保藏3-10天，對染色結(jié)果無明顯影響。
[0018]實(shí)施例2:依以下步驟制備用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑
(1)菌種活化:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌試管斜面從冰箱中取出，分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，直至長出單菌落；
(2)種子培養(yǎng):從活化過的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平板上挑取單菌落，分別接種于含5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，在恒溫振蕩器中37°C、180rpm的條件下培養(yǎng)過夜；
(3)搖瓶培養(yǎng):將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的液體種子按8%的體積比各接種到含有50 mL上述LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在恒溫振蕩器中37°C、175rpm的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；
(4)菌劑制備:按1:1的體積比例取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液加入到同一 5ml離心管中，4°C離心機(jī)中以每分鐘5000rpm的速度離心lOmin，倒掉上清液，然后將離心管倒置于濾紙上充分吸掉液體；
(5)菌劑保藏:將含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌固體混合菌劑的離心管置于4°C冰箱中保藏，保藏3-10天，對染色結(jié)果無明顯影響。
[0019]實(shí)施例3:依以下步驟制備用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑
(1)菌種活化:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌試管斜面從冰箱中取出，分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，直至長出單菌落；
(2)種子培養(yǎng):從活化過的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌平板上挑取單菌落，分別接種于含5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中，在恒溫振蕩器中37°C、200rpm的條件下培養(yǎng)過夜；
(3)搖瓶培養(yǎng):將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的液體種子按10%的體積比例各接種到含有60 mL上述LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在恒溫振蕩器中37°C、200rpm的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；
(4)菌劑制備:按3:1的體積比例取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液加入到同一 5ml離心管中，4°C離心機(jī)中以每分鐘7000rpm的速度離心6min，倒掉上清液，然后將離心管倒置于濾紙上充分吸掉液體；
(5)菌劑保藏:將含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌固體混合菌劑的離心管置于4°C冰箱中保藏，保藏3-10天，對染色結(jié)果無明顯影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，所述的菌劑由大腸桿菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合而成，其特征是該菌劑的制備方法包括如下步驟: (1)菌種活化:將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌試管斜面從冰箱中取出，將其分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜； (2)種子培養(yǎng):將活化過的菌種單菌落分別接種于含5mlLB液體培養(yǎng)基的試管中，在37°C恒溫振蕩器中培養(yǎng)過夜； (3)搖瓶培養(yǎng):將培養(yǎng)好的兩菌株液體種子各接種到含LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，恒溫振蕩器中培養(yǎng)； (4)菌劑制備:按比例取培養(yǎng)好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液加入到同一5ml離心管中離心，然后倒掉上清液，并將離心管倒置于濾紙上，充分吸掉液體； (5)菌劑保藏:將含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的固體混合菌劑的離心管置于冰箱中保藏，保藏3-10天。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(I)中所用的菌為大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(2)中細(xì)菌種子在含5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(3)中，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的液體種子按5-10%的體積比例接種，250mL三角瓶中含有40-60mL LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、150_200rpm。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(4)中培養(yǎng)好的菌為處在對數(shù)生長期中期。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(4)中加入離心管待離心的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液的體積比例為1:3-3:1。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(4)中離心條件為4°C、5000_7000rpm離心5-lOmin。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，其特征是:步驟(5)中菌劑的保存方法為離心后的菌劑連同離心管共同保存于4°C冰箱。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于學(xué)生革蘭氏染色練習(xí)的菌劑的制備方法，該菌劑由大腸桿菌和金黃色葡萄球菌復(fù)合而成，其制備方法為：首先活化大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌種，然后制備其液體種子，繼而進(jìn)行搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，再將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的兩菌培養(yǎng)液按一定比例混合后離心，最后將離心獲得的菌劑連同離心管一并在4℃冰箱中保藏。本發(fā)明的方法簡單，所得菌劑供學(xué)生進(jìn)行革蘭氏染色時可以簡單明了的判斷革蘭氏染色技能的優(yōu)劣，同時可以顯著降低實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的工作量，提高教師工作效率。
【IPC分類】C12R1/19, C12N1/20, C12R1/445
【公開號】CN105087442
【申請?zhí)枴緾N201510522374
【發(fā)明人】李明華, 孟秀梅, 劉連成, 陸正清
【申請人】江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月25日