一種高濃度光合細菌的培養基及其培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種高濃度光合細菌的培養基及其培養方法。
【背景技術】
[0002]光合細菌(photosynthetic bacteria )簡稱PSB，是一類在厭氧光照條件下進行不產氧光合作用或好氧黑暗條件下利用有機物作為供氫體兼碳源的革蘭氏陰性細菌。在分類上屬于紅螺菌目，包含紅螺菌科、紅硫菌科、綠硫菌科和綠色絲狀菌科等四科類，一共有18個屬，約40余種。光合細菌自身營養豐富，細胞干物質中蛋白質含量高達60%，同時還富含有天然抗氧化劑輔酶Q、類胡蘿卜素等生理活性物質。光合細菌在自然界碳素、氮素、硫素轉化中起到重要作用。
[0003]國內外相關研究表明，生產光合細菌的主要方式分為動態培養方式和靜態培養方式。國外有采用透光的密閉式光生物反應器進行動態連續培養光合細菌，國內多采用玻璃缸或塑料袋進行自然發酵培養。在自然發酵過程的中后期，由于營養物質匱乏，難以維持菌體細胞進一步生長；另外由于隨著菌體細胞濃度升高，減弱了光線穿透能力，影響了光合細菌的生長。
[0004]有鑒于此，本發明人研究和設計了一種高濃度光合細菌的培養基及其培養方法，本案由此產生。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種高濃度光合細菌的培養基及其培養方法，在培養過程中，補充莢膜紅假單胞菌生長的營養增強劑濃縮液，延長莢膜紅假單胞菌的生長對數期；在光合細菌四級發酵過程中，每12小時使光照強度逐漸增強；最終制得高濃度的光合細菌。
[0006]為實現上述目的，本發明解決其技術問題的技術方案是:
一種高濃度光合細菌的培養基，包括以下組分:
醋酸鈉5.0 8/1，丙酸鈉1.0 g/L,酵母膏4.0 g/L,氯化鈉2.0 g/L,磷酸氫二鉀0.5g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,碳酸氫鈉2.0 g/L,硫酸銨1.0 g/L,輔助營養液2mL，水998mL，pH 7.0-7.5 ;其中，輔助營養液為:煙酸胺0.005 g/L，生物素0.001區/1，泛酸鈣 0.003 g/L，維生素 BI 0.007 g/L，維生素 B6 0.007 g/L。
[0007]—種高濃度光合細菌的培養方法，包括以下步驟:
步驟一、菌種準備:以莢膜紅假單胞菌作為培養菌株；
步驟二、發酵培養基制備:按照上述的組分配制培養基；
步驟三、一級種子培養:將莢膜紅假單胞菌單菌落接入滅菌過的30mL試管培養基中，橡膠塞密封；在光照培養箱中恒溫培養，溫度30~35°C，光照強度3000~5000Lx ;培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，結束培養，制得一級種子液；
步驟四、二級種子培養:以一級種子液作為種子液，按照體積比15°/『20%的接種量接入滅菌過的100mL三角瓶培養液中，橡膠塞密封；在光照強度3000~5000Lx下厭氧培養，每日搖蕩3~5次；培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，制得二級種子液；
步驟五、三級種子培養:以二級種子液作為種子液，按照體積比15~20%的接種量接入滅菌的1L細口廣口瓶培養液中，橡膠塞密封；在光照強度3000~5000Lx下厭氧培養，每日上下翻轉搖蕩3~5次；培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，結束培養，制得三級種子液；
步驟六、四級發酵培養:以三級種子培養液作為種子液，按照體積比15~20%的接種量接入已經通過1%高錳酸鉀溶液消毒處理的耐高壓、酸堿PE袋中，裝液量為200L，袋口采用消毒的尼龍繩扎緊；在光照強度在2000~4000Lx下，采用上下雙層光照培養；每6小時進行取樣，通過可見光分光光度計測定10倍稀釋發酵液在600nm波長下的吸收值-OD_nni值，直至OD6wnni值不再增加時終止發酵培養。
[0008]作為實施例的優選方式，在所述四級發酵培養過程中的第36小時、60小時分別補加20倍濃縮發酵液；每次補加濃縮發酵液后，上下震蕩培養袋I分鐘，繼續厭氧光照培養；在發酵過程中的每隔12小時調整光照強度，使光照強度逐漸增強，增強幅度為每次10%~20%。
[0009]本發明采用塑料袋靜置發酵培養光合細菌，在發酵過程中分批次補加營養增強劑濃縮液。采用上下兩層光照，并階梯式增強光照強度，直至菌體濃度不再升高時才終止發酵培養。
【附圖說明】
[0010]圖1本發明在發酵過程中0D_nni值的變化曲線；其中，對照組:發酵過程中沒有補加營養濃縮液，光照強度沒有逐漸改變；實驗組:按照本發明培養方法進行。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
一種高濃度光合細菌的培養基，包括以下組分:
醋酸鈉5.0 8/1，丙酸鈉1.0 g/L,酵母膏4.0 g/L,氯化鈉2.0 g/L,磷酸氫二鉀0.5g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,碳酸氫鈉2.0 g/L,硫酸銨1.0 g/L,輔助營養液2mL，水998mL，pH 7.0-7.5 ;其中，輔助營養液為:煙酸胺0.005 g/L，生物素0.001區/1，泛酸鈣 0.003 g/L，維生素 BI 0.007 g/L，維生素 B6 0.007 g/L。
[0012]實施例2
一種高濃度光合細菌的培養方法，包括以下步驟:
步驟一、菌種準備:以莢膜紅假單胞菌作為培養菌株；
步驟二、發酵培養基制備:按照上述的組分配制培養基；
步驟三、一級種子培養:將莢膜紅假單胞菌單菌落接入滅菌過的30mL試管培養基中，橡膠塞密封；在光照培養箱中恒溫培養，溫度30~35°C，光照強度3000~5000Lx ;培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，結束培養，制得一級種子液；
步驟四、二級種子培養:以一級種子液作為種子液，按照體積比15°/『20%的接種量接入滅菌過的100mL三角瓶培養液中，橡膠塞密封；在光照強度3000~5000Lx下厭氧培養，每日搖蕩3~5次；培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，制得二級種子液；
步驟五、三級種子培養:以二級種子液作為種子液，按照體積比15~20%的接種量接入滅菌的1L細口廣口瓶培養液中，橡膠塞密封；在光照強度3000~5000Lx下厭氧培養，每日上下翻轉搖蕩3~5次；培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，結束培養，制得三級種子液；
步驟六、四級發酵培養:在本公司發明的光照增強裝置上進行發酵，以三級種子培養液作為種子液，按照體積比15~20%的接種量接入已經通過1%高錳酸鉀溶液消毒處理的耐高壓、酸堿PE袋中，裝液量為200L，袋口采用消毒的尼龍繩扎緊；在光照強度在2000~4000Lx下，采用上下雙層光照培養；每6小時進行取樣，通過可見光分光光度計測定10倍稀釋發酵液在600nm波長下的吸收值-0D6(Mnni值，直至OD 6(Μηηι值不再增加時終止發酵培養。
[0013]作為實施例的優選方式，在所述四級發酵培養過程中的第36小時、60小時分別補加20倍濃縮發酵液；每次補加濃縮發酵液后，上下震蕩培養袋I分鐘，繼續厭氧光照培養；在發酵過程中的每隔12小時調整光照強度，使光照強度逐漸增強，增強幅度為每次10%~20%。
[0014]實施例3
每隔六小時進行取樣，通過分光光度計對發酵液的10倍稀釋液進行0D_nni值測定，結果如圖1所示。實驗結束后，對照組稀釋10倍后的發酵液的0D_nni值為1.28。而實驗組的0D_nni值為2.57，是對照組的2倍。按照本發明的培養方法發酵，發酵液中的光合細菌濃度將達到20 X 19個/mL。
[0015]本發明在培養過程中的第36小時和第60小時，補充莢膜紅假單胞菌生長的營養增強劑濃縮液，延長莢膜紅假單胞菌的生長對數期。在光合細菌四級發酵過程中，每12小時將光照強度提高10%~20%。采用可見光分光光度計測定10倍稀釋發酵液在600nm波長下的吸收值，即OD6wnni值。直至OD _ηηι值不再增加時才終止發酵，發酵液中的莢膜紅假單胞菌濃度將達到20 X 19個/mL。
[0016]以上所述，僅為本發明較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的范圍，即依本發明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的范圍內。
【主權項】
1.一種高濃度光合細菌的培養基，其特征在于:包括以下組分: 醋酸鈉5.0 8/1，丙酸鈉1.0 g/L,酵母膏4.0 g/L,氯化鈉2.0 g/L,磷酸氫二鉀0.5g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,硫酸鎂0.5 g/L,碳酸氫鈉2.0 g/L,硫酸銨1.0 g/L,輔助營養液2mL，水998mL，pH 7.0-7.5 ;其中，輔助營養液為:煙酸胺0.005 g/L，生物素0.001區/1，泛酸鈣 0.003 g/L，維生素 BI 0.007 g/L，維生素 B6 0.007 g/L。2.—種高濃度光合細菌的培養方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟一、菌種準備:以莢膜紅假單胞菌作為培養菌株； 步驟二、發酵培養基制備:按照如權利要求1所述的組分配制培養基； 步驟三、一級種子培養:將莢膜紅假單胞菌單菌落接入滅菌過的30mL試管培養基中，橡膠塞密封；在光照培養箱中恒溫培養，溫度30~35°C，光照強度3000~5000Lx ;培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，結束培養，制得一級種子液； 步驟四、二級種子培養:以一級種子液作為種子液，按照體積比15°/『20%的接種量接入滅菌過的100mL三角瓶培養液中，橡膠塞密封；在光照強度3000~5000Lx下厭氧培養，每日搖蕩3~5次；培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，制得二級種子液； 步驟五、三級種子培養:以二級種子液作為種子液，按照體積比15~20%的接種量接入滅菌的1L細口廣口瓶培養液中，橡膠塞密封；在光照強度3000~5000Lx下厭氧培養，每日上下翻轉搖蕩3~5次；培養至深棕紅色，菌體濃度在109~101(]個/mL，結束培養，制得三級種子液； 步驟六、四級發酵培養:以三級種子培養液作為種子液，按照體積比15~20%的接種量接入已經通過1%高錳酸鉀溶液消毒處理的耐高壓、酸堿PE袋中，裝液量為200L，袋口采用消毒的尼龍繩扎緊；在光照強度在2000~4000Lx下，采用上下雙層光照培養；每6小時取樣分析，通過可見光分光光度計測定10倍稀釋發酵液在600nm波長下的吸收值_0D600nm值，直至0D6(Mnni值不再增加時終止發酵培養。3.如權利要求2所述的一種高濃度光合細菌的培養方法，其特征在于:在所述四級發酵培養過程中的第36小時、60小時分別補加20倍濃縮發酵液；每次補加濃縮發酵液后，上下震蕩培養袋I分鐘，繼續厭氧光照培養；在發酵過程中的每隔12小時調整光照強度，使光照強度逐漸增強，增強幅度為每次100/『20%。
【專利摘要】本發明公開了一種高濃度光合細菌的培養基及其培養方法，利用本發明的培養基進行莢膜紅假單胞菌發酵培養，在培養過程中的第36小時和第60小時，補充莢膜紅假單胞菌生長的營養增強劑濃縮液，延長莢膜紅假單胞菌的生長對數期；在光合細菌四級發酵過程中，每12小時將光照強度提高10%~20%；采用可見光分光光度計測定10倍稀釋發酵液在600nm波長下的吸收值，即OD600nm值；直至OD600nm值不再增加時才終止發酵；發酵液中的莢膜紅假單胞菌濃度可達到20×109個/mL。本發明可以為大規模生產高濃度的光合細菌起到重要的指導意義。
【IPC分類】C12N1/20
【公開號】CN105087430
【申請號】CN201510443859
【發明人】蔡榮淮, 周勇, 戴志清
【申請人】廈門市科環海洋生物科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年7月27日