小分子牛奶酪蛋白多肽及制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種酪蛋白多肽領域，尤其涉及一種小分子酪蛋白多肽及制備領域。
【背景技術】
[0002] 牛奶是優質的營養食品，但是又是較易引起過敏的食物之一。酪蛋白占牛奶蛋白 總量的80%，是牛乳中含量最高的蛋白質，也是牛奶5種具變應原性蛋白中，變應原性最強 的蛋白質。異性蛋白質，如酪蛋白，由于其分子量過大，進入體內后，未發育成熟的嬰兒胃腸 缺乏分解它們的酶，便作為抗原進入血液循環，刺激人體產生抗體，從而引起過敏反應，如 腹痛、腹脹或腹瀉、哮喘、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎、大便常帶粘液和血等過敏等癥狀。這些 癥狀會給嬰幼兒帶來很大的痛苦。
[0003] 小分子蛋白質或多肽就不會誘發免疫變態反應。但是，小分子蛋白質往往會失去 原形蛋白質的營養和功效。而且，氨基酸本身的味道較苦，分解越充分、純度越高的氨基酸 味道越苦，因此，會影響口感。如何才能讓分解后的小分子蛋白質既有營養，口感又好，一直 是一個難以協調的問題。
【發明內容】
[0004] 發明目的
[0005] 針對現有牛奶乳制品的現狀，發明一種小分子酪蛋白多肽，該多肽既有酪蛋白的 營養，而且對嬰幼兒不易產生變態反應，口感又好的食品添加劑。
[0006] 技術方案
[0007] 本發明為一種小分子牛奶酪蛋白多肽，其序列為VMYQILPQNFLPILQPAVBVPFLQ。其 制備步驟包括（1)將牛奶IL與50-100ml凝乳酶混合，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，得 到凝固沉淀物；（2)將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清； (3)將上清液加入pH4-5的酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉 淀物；（4)將沉淀物溶于pH4. 5-5. 0緩沖液中，經S印hadexG25分離出分子量為2-3KDa的 多肽，即得。所述的凝乳酶，可以是木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶、合 歡蛋白酶、朝鮮薊蛋白酶等。
[0008] 有益效果
[0009] 本發明的制備得到的小分子牛奶酪蛋白多肽，經蛋白質序列測定，序列為 PIPYPILPQNFLPPLQPAVMVPFLQ，純度大于60%。藥理實驗表明，該小分子多肽能顯著促進 Ca、Mg等微量元素的吸收，作用與酪蛋白相當。抗原實驗結果表明，該小分子多肽沒有抗原 性。由于該多肽為小分子多肽，而不是氨基酸，因此口感較好。
【具體實施方式】
[0010] 實施例1
[0011] 將牛奶IL與50ml木瓜蛋白酶混合，離心2000rpm，5分鐘，得到凝固沉淀物；將 凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000rpm，5分鐘，取上清；將上清液加入pH4-5的酸性緩 沖液中，攪拌，離心lOOOOrpm，30分鐘，得到沉淀物；將沉淀物溶于pH4. 5-5.O緩沖液中， 經S印hadexG25,pH7. 2的PBS緩沖液作為流動相，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即 得。采用固相蛋白質自動測序儀測定該多肽的序列為V頂YQILPQNFLPILQPAVBVPFLQ，純度為 82%〇
[0012] 實施例2
[0013] 將牛奶IL與100mL合歡蛋白酶混合，離心3000rpm，10分鐘，得到凝固沉淀物；將 凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心3000rpm，10分鐘，取上清；將上清液加入pH4-5的酸性緩 沖液中，攪拌，離心15000rpm，60分鐘，得到沉淀物；將沉淀物溶于pH4. 5-5. 0緩沖液中， 經S印hadexG25,pH7. 2的PBS緩沖液作為流動相，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即 得。采用固相蛋白質自動測序儀測定該多肽的序列為V頂YQILPQNFLPILQPAVBVPFLQ，純度為 78%〇
[0014] 實施例3
[0015] 免疫原性檢測：BALB/c白鼠6只，雌雄各半，口服分別給予36mg/kg的實施例1制 備得到的多肽。連續給藥8周，于1-12周眼眶靜脈叢定點取血每周一次，12000rpm離心 2min，分離血漿取上清液，-20 °C低溫保存備用。待室溫溶解后，取0.Iml上清液間接ELISA 檢測血清中抗體滴度，其中所述的ELISA檢測試劑盒購自上海生工。以各樣品實際A值 (0D450)比陰性對照血清A值即得RA值，RA彡2. 1即為陽性，將Bloodbio-samples樣品 作一系列稀釋后進行檢測，呈陽性反應的最高稀釋度即為該樣品的滴度。測定結果顯示。 1-12周收集的血樣，經ELISA間接法檢測多肽誘導抗體的RA均小于1. 7,均為陰性。由此 可見，本發明得到的小分子牛奶酪蛋白多肽無免疫原性。
[0016] 實施例4
[0017] 血清中鈣離子的含量：ICR白鼠40只，雌雄各半，隨機分成4組，每組10只，分別 為空白組、牛奶組、酪蛋白多肽低、高劑量組，分別口服生理鹽水、牛奶、酪蛋白多肽9,36mg/ kg。連續給藥4周，于第四周末次給藥后眼眶靜脈叢定點取血測血清中鈣含量。
[0018] 結果：如表1，酪蛋白多肽低、高劑量組均能顯著性升高血清中鈣離子的含量 (P〈0. 05)，與牛奶組相比無差異。
[0019] 表1小分子牛奶酪蛋白多肽對血清f丐離子含量的影響（means土s)
[0020]
[0021] #p〈0.05模型組相比。
【主權項】
1. 一種小分子牛奶酪蛋白多肽，其特征在于，序列為V頂YQILPQNFLPILQPAVBVPFLQ。2. 根據權利要求1所述小分子牛奶酪蛋白多肽的制備方法，其特征在于，步驟包括（1) 將牛奶IL與50-100ml凝乳酶混合，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，得到凝固沉淀物；（2) 將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（3)將上清液加入 PH4-5的酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；（3 )將沉淀物 溶于pH4. 5-5. 0緩沖液中，經S印hadex G25,分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。3. 根據權利要求書2小分子牛奶酪蛋白多肽的制備方法，其特征在于，所述的凝乳酶 是木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶、生姜蛋白酶、合歡蛋白酶或朝鮮薊蛋白酶。
【專利摘要】本發明公開了一種小分子牛奶酪蛋白多肽，主要涉及一種小分子酪蛋白多肽及制備領域。其序列為VIMYQILPQNFLPILQPAVBVPFLQ。其制備步驟包括（1）將牛奶1L與50-100ml凝乳酶混合，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，得到凝固沉淀物；（2）將凝固沉淀物加入水中，煮沸，離心2000-3000rpm，5-10分鐘，取上清；（3）將上清液加入pH4-5的酸性緩沖液中，攪拌，離心10000-15000rpm，30-60分鐘，得到沉淀物；（4）將沉淀物溶于pH4.5-5.0緩沖液中，經Sephadex？G25，分離出分子量為2-3KDa的多肽，即得。本發明的有意效益在于制備得到的多肽純度大于60%，能顯著促進Ca、Mg等微量元素的吸收，作用與酪蛋白相當，無抗原性，口感較好。
【IPC分類】C12P21/06, C07K1/14, C07K14/47
【公開號】CN105085650
【申請號】CN201510548497
【發明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達生物科技有限公司
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月31日