一種利用高速逆流色譜法從馬藺子中分離制備低聚芪類化合物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用高速逆流色譜法從馬藺子中分離制備低聚芪類化合物的方 法。
【背景技術】
[0002] 馬藺（Iris lactea Pall. var. chinensis (Fisch. )Koidz.)，亦稱馬蓮、馬蘭、藍紫 草、蘭花草等，是鸞尾科（Iridaceae)鸞尾屬（Iris L )多年生草本宿根植物。馬藺自然分 布于我國東北、華北、西北等地，以草原區分布較為普遍。馬藺子味甘，性平，涼血止血，清熱 利濕。近代民間有用作口服避孕藥和治療功能性子宮出血、黃疸型肝炎及宮頸癌等疾病。目 前，從鳶尾屬中分離得到了多種化合物，主要包括黃酮類化合物及其糖苷、異黃酮類化合物 及其糖苷、苯醌類化合物、三萜類化合物及其皂苷、芪類化合物。
[0003] 低聚芪類化合物具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、神 經保護等作用。為有效開發利用馬藺子資源，以及進一步研究低聚芪類化合物的藥理活性 及作用機制，開發從馬藺子中快速制備高純度低聚芪類化合物的方法具有重要的意義。而 對低聚芪類化合物的分離多采用傳統柱色譜分離，由于傳統柱色譜具有分離周期長、消耗 大量有機溶劑、對樣品的死吸附嚴重等不足。因此，有必要探索一些高效的方法來制備高純 度的低聚芪類化合物。
[0004] 高速逆流色譜（High-speed counter-current chromatography，簡稱HSCCC)分離 技術是一種連續高效的液-液分配色譜分離技術，它不用任何固態的支撐物或載體，利用 兩相溶劑體系在高速旋轉的螺旋管內建立起一種特殊的單向性流體動力學平衡，其中一相 作為固定相，另一相作為流動相，在連續洗脫的過程中能保留大量的固定相，物質的分離依 據其在兩相中分配系數的不同而實現，特別適合于天然產物活性成分的分離。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供一種利用HSCCC技術從馬藺子中提取分離四種低聚芪類 化合物的方法。
[0006] 具體地，本發明提供了一種利用高速逆流色譜法從馬藺子中分離制備低聚芪類化 合物的方法，它包括如下操作步驟：
[0007] (1)粗提物的制備：
[0008] 將馬藺子粉碎后，用50-90% v/v乙醇提取，提取液減壓濃縮回收溶劑后得到乙醇 粗提物，即待分離樣品；
[0009] (2)采用高速逆流色譜法分離vitisin A、流分II和e _viniferin( e-葡萄素）：
[0010] 取正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為2~6 : 4~7 : 2~6 : 3~7,置于 分液漏斗中配制兩相溶劑系統，取上相為固定相，下相為流動相；將固定相充滿逆流色譜的 色譜柱，在25~35°C下，主機正轉，轉速為800~900r/min，然后以1. 5~lOml/min的流 速栗入流動相，至兩相溶劑在柱中達到平衡狀態；步驟（1)制備的粗提物，以流動相為溶劑 溶解，制備樣品溶液；將樣品溶液進樣，在紫外檢測器下分別接收各目標成分，濃縮、干燥， 即可分別得到vitisin A、流分II和e -viniferin ;
[0011] (3)采用高速逆流色譜法分離vitisin B和vitisin C :
[0012] 取石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為2~7 : 2~7 : 2~7 : 2~7,置 于分液漏斗中配制兩相溶劑系統，取下相為固定相，上相為流動相；將固定相充滿逆流色譜 的色譜柱，在25-35°C下，主機正轉，轉速為800~900r/min，然后以1. 5~lOml/min的流 速栗入流動相，至兩相溶劑在柱中達到平衡狀態；取流分II，以流動相為溶劑溶解，制備樣 品溶液；將樣品溶液進樣，在紫外檢測器下分別接收各目標成分，濃縮、干燥，即可分別得到 vitisin B 和 vitisin C ；
[0013] 其中，步驟（2)、（3)中的紫外檢測波長為325nm。
[0014] 進一步地，步驟（1)中，乙醇濃度為75~90% v/v，優選為80~90% v/v，更優選 為 85% v/v。
[0015] 進一步地，步驟（1)中，乙醇提取次數為1~5次，優選為3次。
[0016] 進一步地，步驟（2)中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為2.5~3 : 6~ 6. 5 : 4 ~4. 5 : 5 ~5. 5。
[0017] 進一步地，步驟（2)中，vitisin A、流分II和e-viniferin的出峰時間依次為 40 ~130min、75 ~175min、90 ~205min。
[0018] 本發明一個【具體實施方式】中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為 3 : 6.5 : 4.2 : 5. 5, vitisin A、流分II和e-viniferin各成分的出峰時間依次為60~ 80min、115 ~135min、140 ~155min〇
[0019] 本發明另一個【具體實施方式】中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為 2. 5 : 6 : 4.5 : 5，vitisin A、流分II和e-viniferin各成分的出峰時間依次為90~ 130min、145 ~175min、180 ~205min〇
[0020] 本發明另一個【具體實施方式】中，正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為 3:6.4:5，￥；11:18；[11厶、流分11和￡-￥；[111€61'；[11各成分的出峰時間依次為40~60111；[11、 75 ~85min、90 ~105min0
[0021] 進一步地，步驟（2)中，在25°C下，主機正轉，轉速為900r/min，然后以1.5~ 2. 5ml/min的流速栗入流動相。
[0022] 進一步地，步驟（3)中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為5 : 5 : 3 : 6~ 1。
[0023] 進一步地，步驟（3)中，vitisin C和vitisin B的出峰時間依次為135~182min、 145 ~200min。
[0024] 本發明一個【具體實施方式】中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為 5 : 5 : 3 : 6，vitisin C和 vitisin B 的出峰時間依次為 135 ~142min 和 145 ~155min。
[0025] 本發明另一個【具體實施方式】中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為 5 : 5 : 3 : 7，vitisin C和 vitisin B 的出峰時間依次為 155 ~182min 和 185 ~200min。
[0026] 本發明另一個【具體實施方式】中，石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為 5 : 5 : 3 : 6，vitisin C和 vitisin B 的出峰時間依次為 135 ~142min 和 145 ~155min。
[0027] 進一步地，步驟（3)中，在35°C下，主機正轉，轉速為800r/min，然后以3.0~ 5. Oml/min的流速栗入流動相。
[0028] 本發明的優點：
[0029] 1、與傳統柱色譜分離技術相比，本發明采用高速逆流色譜（HSCCC)分離技術，不 但有效地縮短了分離時間，而且減少了工藝過程中的有機溶劑消耗和能耗。
[0030] 2、本發明通過兩次HSCCC分離可以得到4種高純度（可達到95%以上）低聚芪類 化合物，BP vitisin A、e-viniferin、vitisin B 和 vitisin C。
[0031] 3、本發明制備所得4種低聚芪類化合物分別經UV、ID (1H-NMR和13C-NMR)和 20(?-? COSY，HMBC和HSQC)核磁譜進行結構確認鑒定。
[0032] 下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但本發明并不限于以下實施例。所 述方法如無特別說明均為常規方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業途徑而得。
【附圖說明】
[0033] 圖1為馬藺子乙醇粗提取物、流分II、vitisin A、e-viniferin、vitisin B及 vitisin C的高效液相色譜圖
[0034] 圖 2 為 vitisin A、e-viniferin、vitisin B 及 vitisin C 的全波長掃描圖
[0035] 圖3為本發明應用高速逆流色譜法分離制備vitisin A、e -viniferin和流分II 的分離制備圖
[0036] 圖4為本發明應用高速逆流色譜法分離制備vitisin B和vitisin C的分離制備 圖
[0037] 圖5溶劑系統為"正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為4 : 6 : 5 : 5"時，流 分1，流分II和流分2的分離制備圖譜
[0038] 圖6溶劑系統為"石油醚、乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為5 : 5 : 3 : 6"時，流 分3和流分4的分離制備圖譜
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例所用儀器與試劑均如下所示：
[0040] TBE-300C高速逆流色譜儀（上海同田生物技術有限公司）；同時配有TBP5002恒 流栗（上海同田生物技術有限公司），DC-0506低溫恒溫槽（上海舜宇恒平科學儀器有限公 司），UV-2000D檢測器（上海同田生物技術有限公司）和EasyChrom-1000 色譜數據工作 站（上海同田生物技術有限公司）。Agilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司），配有 G1311C四級栗，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱和G131?二極管陣列檢測器。
[0041] 下述實施例中均采用HPLC法對各流分進行純度檢測（峰面積歸一法），其色譜條 件為：Eclipse XDB (：18柱（250mmX4. 6mm，5 ym);流動相：甲醇-乙腈-水溶液；梯度洗脫 程序具體如下：0-20min，流動相為30-50 %的甲醇，的5 % -5 %乙腈；21-35min，流動相為 50-65%的甲醇，5% -5%乙腈；流速：1.0ml/min ;柱溫箱溫度為30°C ;檢測波長為325nm。
[0042] 實施例1
[0043] 一種利用高速逆流色譜法從馬藺子中分離制備低聚芪類化合物的方法包括以下 步驟：
[0044] (1)將馬藺子粉碎后，用85%乙醇提取3次，過濾，減壓濃縮回收溶劑后得到乙醇 粗提物，即待分離樣品
[0045] (2)將含有正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水的有機溶劑體系混合均勻后靜置分層，分 別取上層溶劑和下層溶劑，超聲脫氣20min，以上層溶劑作為固定相，下層溶劑作為流動相， 向高速逆流色譜儀的分離管中栗入所述固定相，保持分離管溫度25°C，以900rpm的轉速正 轉20min后，栗入流動相，待體系平