一種獲取西蘭花毛狀根的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種毛狀根的獲取方法，尤其涉及一種獲取西蘭花毛狀根的方法。
【背景技術】
[0002]西蘭花中含有豐富的抗癌物質蘿卜硫素，被美國《時代周刊》評為十大最佳營養蔬菜之一。西蘭花可以增強機體免疫力、促進生長、增強血管韌性等功效，可以預防患乳腺癌、胃癌等癌癥的風險。
[0003]西蘭花中的次生代謝產物蘿卜硫素由于具有防癌、抗癌的功效，在醫學上有著重要的應用價值。而目前通常是從西蘭花種子或西蘭花幼苗中獲取，由于其種子原料成本過高，西蘭花的育種方式復雜且周期長，并且西蘭花種子與幼苗中的蘿卜硫素含量低，無法滿足日常生活中人們對蘿卜硫素的需求。此外傳統的種植技術對植物的產量和質量都有較大的影響，不利于產業化生產。若建立西蘭花毛狀根的誘導及培養體系，通過培養大量的毛狀根來提高蘿卜硫素的產量將是一種應用于工業化中簡單、快速的方法。
[0004]雖然在個別植物中已經實現了通過發根農桿菌介導植物外植體而獲得毛狀根，如煙草、新疆雪蓮等，并且獲得的這些毛狀根具有自主生長、多根毛等特點，但到目前為止，國內外還未見利用發根農桿菌Ri質粒介導西蘭花毛狀根培養體系的報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種簡單、高效的獲取西蘭花毛狀根的方法。
[0006]為解決上述問題，本發明所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟: ⑴在超凈工作臺上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無菌苗外植體，放在無菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2~8個傷口，并接種于MS培養基中，最后于25°C暗處預培養2~7d，得到預培養的無菌苗外植體；
⑵將所述預培養的無菌苗外植體用0D_為0.2-0.8的發根農桿菌在25 °C侵染2~10min，然后用無菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為50~200 ymol/L乙酰丁香酮的MS培養基上，于25°C暗處共培養2~8d，得到共培養后的受體外植體；
⑶所述共培養后的受體外植體轉接于添加濃度為80~300mg/L羧芐青霉素二鈉的MS培養基中，于25°C暗培養，每5d轉接一次，經2~5次轉接后即可獲得無菌毛狀根。
[0007]所述步驟⑴中剪取的西蘭花無菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長的莖段。
[0008]所述步驟⑵中發根農桿菌的型號為ATCC11325、R1601、ATCC15834中的任意一種。
[0009]所述MS培養基的pH值均為5.8。
[0010]本發明與現有技術相比具有以下優點:
1、本發明在國內外未有類似報道，在獲取毛狀根時侵染時間短，誘導率高(40.34%~73.64%)，且其浸染所得毛狀根中次生代謝產物蘿卜硫素含量(可達3689.35 μ g/g)較西蘭花種子、葉片等組織高30~200倍，具有較好的市場開發前景。
[0011]2、本發明投資少，工藝簡單，適合工廠化生產。
【具體實施方式】
[0012]實施例1 一種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟:
⑴在超凈工作臺上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無菌苗外植體，放在無菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2個傷口，并接種于pH值為5.8的MS培養基中，最后于25°C暗處預培養2d，得到預培養的無菌苗外植體。
[0013]其中:剪取的西蘭花無菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長的莖段。
[0014]⑵將預培養的無菌苗外植體用OD6。。為0.2的發根農桿菌在25°C侵染2min，然后用無菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為50 μ mol/L乙酰丁香酮且pH值為5.8的MS培養基上，于25°C暗處共培養2d，得到共培養后的受體外植體。
[0015]其中:發根農桿菌的型號為ATCC11325。
[0016]⑶共培養后的受體外植體轉接于添加濃度為80mg/L羧芐青霉素二鈉且pH值為5.8的MS培養基中，于25°C暗培養，每5d轉接一次，經2次轉接后即可獲得無菌毛狀根。毛狀根誘導率可達52.56%ο
[0017]實施例2 —種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟:
⑴在超凈工作臺上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無菌苗外植體，放在無菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎5個傷口，并接種于pH值為5.8的MS培養基中，最后于25°C暗處預培養5d，得到預培養的無菌苗外植體。
[0018]其中:剪取的西蘭花無菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長的莖段。
[0019]⑵將預培養的無菌苗外植體用OD6。。為0.6的發根農桿菌在25°C侵染6min，然后用無菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為150ymol/L乙酰丁香酮且pH值為5.8的MS培養基上，于25 °C暗處共培養5d，得到共培養后的受體外植體。
[0020]其中:發根農桿菌的型號為ATCC15834。
[0021]⑶共培養后的受體外植體轉接于添加濃度為150mg/L羧芐青霉素二鈉且pH值為5.8的MS培養基中，于25 °C暗培養，每5d轉接一次，經4次轉接后即可獲得無菌毛狀根。毛狀根誘導率可達73.64%ο
[0022]實施例3 —種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟:
⑴在超凈工作臺上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無菌苗外植體，放在無菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎8個傷口，并接種于pH值為5.8的MS培養基中，最后于25°C暗處預培養7d，得到預培養的無菌苗外植體。
[0023]其中:剪取的西蘭花無菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長的莖段。
[0024]⑵將預培養的無菌苗外植體用OD6。。為0.8的發根農桿菌在25°C侵染lOmin，然后用無菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為200 μ mol/L乙酰丁香酮且pH值為5.8的MS培養基上，于25 °C暗處共培養8d，得到共培養后的受體外植體。
[0025]其中:發根農桿菌的型號為R1601。
[0026]⑶共培養后的受體外植體轉接于添加濃度為300mg/L羧芐青霉素二鈉且pH值為
5.8的MS培養基中，于25°C暗培養，每5d轉接一次，經5次轉接后即可獲得無菌毛狀根。毛狀根誘導率為40.34%ο
【主權項】
1.一種獲取西蘭花毛狀根的方法，包括以下步驟: ⑴在超凈工作臺上，用高溫滅菌后的剪刀剪取同一批快繁的西蘭花無菌苗外植體，放在無菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2~8個傷口，并接種于MS培養基中，最后于25°C暗處預培養2~7d，得到預培養的無菌苗外植體； ⑵將所述預培養的無菌苗外植體用0D_為0.2-0.8的發根農桿菌在25 °C侵染2~10min，然后用無菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加濃度為50~200 ymol/L乙酰丁香酮的MS培養基上，于25°C暗處共培養2~8d，得到共培養后的受體外植體； ⑶所述共培養后的受體外植體轉接于添加濃度為80~300mg/L羧芐青霉素二鈉的MS培養基中，于25°C暗培養，每5d轉接一次，經2~5次轉接后即可獲得無菌毛狀根。2.如權利要求1所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，其特征在于:所述步驟⑴中剪取的西蘭花無菌苗外植體為0.5cm2的葉片和0.5cm長的莖段。3.如權利要求1所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，其特征在于:所述步驟⑵中發根農桿菌的型號為ATCCl 1325、R160UATCC15834中的任意一種。4.如權利要求1所述的一種獲取西蘭花毛狀根的方法，其特征在于:所述MS培養基的pH值均為5.8。
【專利摘要】本發明涉及一種獲取西蘭花毛狀根的方法，該方法包括以下步驟：⑴剪取同一批快繁的西蘭花無菌苗外植體，放在無菌濾紙上，然后用滅菌的針頭在其表面扎2~8個傷口，并接種于MS培養基中，最后于暗處預培養，得到預培養的無菌苗外植體；⑵將所述預培養的無菌苗外植體用發根農桿菌侵染，然后用無菌濾紙吸干其表面殘留的菌液，并接種于添加乙酰丁香酮的MS培養基上，于暗處共培養，得到共培養后的受體外植體；⑶所述共培養后的受體外植體轉接于添加羧芐青霉素二鈉的MS培養基中，于暗培養，每5d轉接一次，經2~5次轉接后即可獲得無菌毛狀根。本發明簡單、高效，適合工廠化生產。
【IPC分類】C12N15/82, C12N5/10
【公開號】CN105063084
【申請號】CN201510554153
【發明人】馬紹英, 李勝, 胡翠珍, 趙生琴
【申請人】甘肅農業大學
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月2日