內切型β瓊膠酶AgaB的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及瓊膠酶，尤其是涉及一種內切型e瓊膠酶AgaB的制備方法。
【背景技術】
[0002] 瓊膠酶是一類微生物獲取外界碳源的工具酶，能夠將大分子的瓊脂糖降解成小分 子的瓊膠寡糖。由于其降解瓊脂糖的屬性，因此經常被用于DNA回收，藻類原生質體制備等 領域。隨著海藻寡糖研究的興起與深入，越來越多的研究證明，瓊膠寡糖具有多種生理功 能，例如抗癌、抗炎、抗氧化、美白、增加腸道益生菌等。與傳統的酸堿制備法相比，瓊膠酶酶 解法高效、溫和、低耗、產物穩定，是制備瓊膠寡糖的首選方法。因此，瓊膠酶具有一定的科 研與醫療保健應用價值。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種內切型0瓊膠酶AgaB的制備方法。
[0004] 本發明包括以下步驟：
[0005] 1)瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92 的發酵；
[0006] 2)瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92發酵液的硫酸銨鹽析；
[0007] 3)AgaB粗酶液經DEAE瓊脂糖離子層析純化。
[0008] 所述Flammeovirgasp.SJP920 -瓊膠酶已于2014年11月27日保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學 院微生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo. 10071。
[0009] 本發明通過瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92的發酵，將發酵液經硫酸銨鹽析 以及DEAE瓊脂糖離子層析等步驟純化得到內切型0瓊膠酶AgaB。純化得到的這兩種瓊膠 酶純度高，活力好，為其實際應用提供了基礎，同時，這兩種瓊膠酶純化工藝的建立也為其 工業化應用奠定了基礎。
【附圖說明】
[0010] 圖1為AgaB的SDS-PAGE與酶活染色圖。M:蛋白質分子質量標準品；1 :AgaB的 SDS-PAGE;2:AgaB的酶活染色。
[0011] 圖2為pH值對AgaB活力的影響。橫坐標為pH值，縱坐標為相對活力。
[0012] 圖3為溫度對AgaB活力的影響。橫坐標為溫度，縱坐標為相對活力。
[0013] 圖4為AgaB的溫度穩定性。橫坐標為時間，縱坐標為相對活力，3條曲線分別為 AgaB在40、45、50 °C下隨時間變化的活力曲線。
[0014] 圖5為薄層層析法分析AgaB的酶解產物。DP4:瓊膠四糖；DP6:瓊膠六糖；DP8:瓊 膠八糖。
[0015] 圖6為核磁共振法分析AgaB的酶解產物。A為3、6_內醚-a-L-半乳糖；B為 0 -D-半乳糖；r為還原端；nr為非還原端；a為a異頭碳；0為0異頭碳。
【具體實施方式】
[0016] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。
[0017] 為實現上述目的，本發明采用以下技術措施，其具體步驟是：
[0018] 1、瓊膠酶菌株Flammeovirga sp.SJP92 的發酵
[0019] 挑取Flammeovirgasp.SJP92單菌落于2216E培養基中（成分為2 %氯化鈉， 0. 3 %六水氯化鎂，0. 6 %七水硫酸鎂，0. 1 %硫酸銨，0. 02 %碳酸氫鈉，0. 03 %二水氯化?丐， 0. 05 %氯化鉀，0. 042 %磷酸二氫鉀，0. 005 %溴化鈉，0. 002 %六水氯化硒，0. 001 %檸檬酸 銨鐵，0. 1%酵母粉和0. 5%蛋白胨，pH為7. 6)，32°C下200r/min培養12h，即為種子液。添 加1%的種子液于含〇.2%瓊膠粉的2216￡培養基中（此培養基由2216￡液體培養基加入 〇.2%瓊膠粉配制而成）中，32°(：下20(^/ 1^11發酵培養4211，即為發酵液。
[0020] 2、瓊膠酶菌株Flammeovirgasp.SJP92發酵液的硫酸銨鹽析
[0021] Flammeovirgasp.SJP92的發酵液13000r/min離心收集上清。在冰浴條件下， 往發酵液上清添加硫酸銨固體粉末至飽和度為40% (硫酸銨粉末添加過程中邊添加邊攪 拌）。硫酸銨粉末溶解完全后，4°C靜置2h，13000r/min離心30min，收集上清，繼續往發酵 液上清添加硫酸銨固體粉末至飽和度為80%。待硫酸銨粉末溶解完全后，4°C靜置過夜， 13000r/min離心30min，收集沉淀。沉淀用少量20mM，pH值為7. 8的Tris?HC1緩沖液溶 解，并置于同樣的緩沖液中透析，共透析3次，每次3h。透析后的酶液即為AgaB粗酶液。
[0022] 3、AgaB粗酶液經DEAE瓊脂糖離子層析純化
[0023] 去除DEAE瓊脂糖離子填料的保存液，加入雙蒸水，混勻成膠漿，靜置至填料沉淀， 去除上清，以此方法用雙蒸水漂洗填料5遍，完全去除填料的保存液。往填料中加入20mM， pH值為7. 8的Tris*HC1緩沖液，混勻成膠漿，重新靜置至填料沉淀，去除上清，以此方法用 20mM，pH值為7. 8的Tris?HC1緩沖液平衡填料5遍，充分平衡DEAE瓊脂糖離子填料。將 平衡好的DEAE瓊脂糖離子填料加入AgaB粗酶液，顛倒混勻lh，3000r/min離心，取沉淀，沉 淀用少量的20mM，pH值為7. 8的Tris.HC1緩沖液混勻成膠漿裝柱。用氯化鈉濃度為0~ 〇. 3M的梯度洗脫液線性梯度洗脫，洗脫速度為1. 47mL/min，每管收集5mL。測定各管收集液 的瓊膠酶活力，并繪制酶活曲線。根據酶活曲線，將具有瓊膠酶活力的各管收集液合并，置 于3KDa超濾管中6000r/min離心濃縮，濃縮液即為AgaB的純酶液。
[0024] 4、AgaB的酶學性質
[0025] 4. 1AgaB酶活力的測定
[0026] 取1yLAgaB的純酶液與399yL溶于含有0.2 %瓊脂糖的PBS(該溶液 購自上海生工，成分為磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，氯化鈉，氯化鉀，pH值為7.0)的 混合。將混合液在40 °C水浴30min，添加400yLDNS試劑（1、MillerGL.Useof dinitrosalicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugar.Analytical chemistry. 195931:426-8)，沸水加熱10min，在540nm波長下測定反應產物的吸光值。參 照半乳糖標準曲線計算還原糖產量，計算酶活。一個單位（U)的酶活定義為每分鐘釋放 lymol的還原糖所需要的酶量。實驗重復三次取平均值。通過活力檢測，AgaB的比活力為 1025.28U/mg〇
[0027] 4. 2AgaB的酶活染色分析
[0028] 將AgaB的純酶液進行SDS-PAGE電泳，待電泳結束后，將凝膠放入到PBS中洗脫 30min，其間更換2次洗脫液，以去除SDS。將去除SDS的凝膠平鋪在一塊濃度為1.5%的瓊 脂糖膠上，40°C下反應30min后，取下凝膠，向瓊脂糖膠上滴加盧戈氏碘液（水溶液中含有 5% 12和10%KI)。若在SDS-PAGE凝膠上存在瓊膠酶活性，則會在深褐色的瓊脂糖膠上出 現透明的條帶，反之則無。結果表明，所制備的內切型0瓊膠酶AgaB具有瓊膠酶活性（圖 1)〇
[0029] 4. 3AgaB酶活pH的測定
[0030]分別用 20mM的NaAc?HAc緩沖液（pH值為 4. 5 ~5. 5)，Na2HP04?NaH2P04緩沖液 (pH值為6. 0~7. 5)，Tris?HC1緩沖液（pH值為8. 0~9. 0)代替反應體系中的PBS，在 40°C下測定各組的瓊膠酶活力，結果表明AgaB在pH值為4. 5~9區間均有活性，pH值中 性區間是它活力較大的區間，且pH值為7. 0時，其活力最大（圖2)。
[0031] 4. 4AgaB酶活溫度的測定
[0032] 取1yLAgaB的純酶液與399yL含有0. 2%瓊脂糖的PBS混合，將反應體系分別 置于30~75 °C溫度下測定各組的瓊膠酶活力。結果表明AgaB在35~65 °C區間均有活性， 40-50°C是它活力較大的區間，其最適溫度為40°C(圖3)。
[0033] 4. 5AgaB溫度穩定性的測定
[0034] 取1yLAgaB的純酶液與399yL含有0. 2%瓊脂糖的PBS混合，將反應體系分別 置于30~75°C溫浴2. 5h，而后分別取樣，測定活力。結果表明AgaB在最適溫度40°C下最 為穩定，溫浴150min后仍可以保持95 %以上的酶活。但在45°C和50°C下，活力則損失36 % 和 62% (圖 4)。
[0035] 4.6金屬離子與變性劑對AgaB活力的影響
[0036] 取1yLAgaB的純酶液與399yL含有0.2%瓊脂糖的PBS混合，分別在反應體系 中加入相應濃度的化學試劑，檢測各組的瓊膠酶活力。以不添加任何額外試劑的反應體系 為對照，計算酶活力變化的百分比。結果表明Ca2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Fe3+、Cu2+和NH4+對AgaB 的活力均有抑制作用，其中Zn2+，Fe3+和Cu2+幾乎使AgaB失去了活性。其余的金屬離子與 變性劑對AgaB沒有明顯的影響，金屬離子與變性劑對AgaB活力的影響參見表1。
[0037] 表2金屬離子與變性劑對AgaB活力的影響
[0038]
[0039] 4. 7AgaB的酶解產物分析：
[0040] 1)薄層層析法分析AgaB的酶解產物
[0041 ] 將AgaB的純酶液按1 : 39的體積比加入到瓊脂糖濃度為0? 3 % (w/v)的PBS中， 于40°C進行酶解反應，分別取不同時間（Omin、lmin、5min、10min、30min、lh、3h、12h)的反 應產物在硅膠板上點樣，待樣品完全干透，置于層析缸中展層，展層液成分為氯仿：甲醇： 冰乙酸=2 : 2 :l(v:v:V)，待前沿到達硅膠板頂端時取出硅膠板。冷風將硅膠板吹 干，噴顯色劑（無水乙醇：濃硫酸=9 : 1)，冷風吹干，置于95°C烘箱顯色lOmin。結果表 明，AgaB是一種內切酶，它降解的最終產物是6糖和4糖（圖5)。
[0042] 2)核磁共振法分析AgaB的酶解產物
[0043] 將AgaB的純酶液按1 : 39的體積比加入到15mL瓊脂糖濃度為0. 3 % (w/v)的雙 蒸水中，于40°C溫浴酶解lh。待酶解完畢后，將酶解的寡糖溶液置于3KDa超濾管中6000r/ min離心過濾，收集濾出液冷凍干燥。將凍干粉末用0. 5mL氘代水溶解，于核磁共振譜儀進 行13C核磁共振，所得數據用MestReNova進行分析。結果表明，AgaB為0瓊膠酶，其酶解 產物為新瓊膠寡糖（圖6)。結合薄層層析結果可知，AgaB為內切型的0瓊膠酶，其酶解終 產物為新瓊四糖和新瓊六糖。
【主權項】
1.內切型P瓊膠酶AgaB的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 瓊膠酶菌株Flammeovirga sp. SJP92的發酵； 2) 瓊膠酶菌株Flammeovirga sp.SJP92發酵液的硫酸銨鹽析； 3. AgaB粗酶液經DEAE瓊脂糖離子層析純化； 所述Flammeovirga sp.SJP920-瓊膠酶已于2014年11月27日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微 生物研究所，郵編：1〇〇1〇1，保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 10071。
【專利摘要】內切型β瓊膠酶AgaB的制備方法，涉及瓊膠酶。1)瓊膠酶菌株Flammeovirga？sp.SJP92的發酵；2)瓊膠酶菌株Flammeovirga？sp.SJP92發酵液的硫酸銨鹽析；3)AgaB粗酶液經DEAE瓊脂糖離子層析純化。通過瓊膠酶菌株Flammeovirga？sp.SJP92的發酵，將發酵液經硫酸銨鹽析以及DEAE瓊脂糖離子層析等步驟純化得到內切型β瓊膠酶AgaB。純化得到的這兩種瓊膠酶純度高，活力好，為其實際應用提供了基礎，同時，這兩種瓊膠酶純化工藝的建立也為其工業化應用奠定了基礎。CGMCC No.1007120141127
【IPC分類】C12N9/42
【公開號】CN105062994
【申請號】CN201510609318
【發明人】阮靈偉, 黃能平, 施泓, 徐洵
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年9月23日