一種提高甲醇營養型酵母表達系統表達量的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種能提高甲醇營養型酵母表達系統表達 重組蛋白表達量的方法。
【背景技術】
[0002] 酵母表達系統是目前應用最廣泛的外源基因表達系統之一，而其中的甲醇營養型 酵母營養要求低、生長快、培養基廉價，易于進行操作和培養；表達的外源蛋白可分泌到胞 外，分泌的內源蛋白少，外源蛋白分離純化簡便，尤其是甲醇營養型酵母中的畢赤酵母已被 廣泛運用于生產中。
[0003] 然而畢赤酵母在表達重組蛋白過程中，對于易降解類蛋白在發酵過程中容易被其 自生酶系所降解，這對重組蛋白的表達積累非常不利。一般采取提高發酵過程氮源水平以 降低菌體自身蛋白酶對重組蛋白的降解，此方法容易造成物料的浪費進而使發酵成本升 高，且增加的氮源并不一定對重組蛋白的表達有較好的提升效果，同時發酵結束殘余的氮 源可能對后期提取純化造成一定難度。也有在培養基中添加蛋白酶抑制劑來抑制重組蛋白 的降解的方案，但效果并不顯著，目前沒有較好的方法大幅減少重組蛋白的降解，所以尋找 抑制蛋白降解的方法顯得十分重要。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是針對現有技術不足，開發一種提高甲醇營養型酵母表達系統表達 重組蛋白表達量的方法。
[0005] 為達到上述目的，本發明提供了一種提高甲醇營養型酵母表達系統表達量的方 法：在甲醇營養型酵母發酵誘導階段中，流加的甲醇中含有蛋白酶抑制劑。
[0006] 在一些實施方案中，蛋白酶抑制劑為苯甲脒鹽酸鹽或苯甲基磺酰氟。
[0007] 在另一些實施方案中，蛋白酶抑制劑為苯甲脒鹽酸鹽。
[0008] 在一些實施方案中，蛋白酶抑制劑的含量為0? 005mol/L~0? 15mol/L〇 [0009] 在一些實施方案中，甲醇營養型酵母為巴斯德畢赤酵母。
[0010] 在一些實施方案中，表達的重組蛋白選自羧肽酶B前體、胰島素前體、胰島素前體 類似物、促胰高血糖素類前體或胰蛋白酶前體。
[0011] 本發明使用的術語"前體"指通過一個或者多個隨后的化學和/或酶促步驟可以 得到目的蛋白的單鏈多肽。"胰島素前體類似物"指A和/或B鏈相對于人胰島素分子具有 一個或多個突變、替代、刪除、和/或添加的胰島素前體分子。同理，如利用基因工程重組表 達促胰高血糖素類、甘精胰島素、門冬胰島素、德谷胰島素、賴脯胰島素、胰蛋白酶、羧肽酶 等，都是表達各自的單鏈多肽，也就是前體蛋白，這些屬于本領域技術公知。
[0012] 除非明確地說明與此相反，否則，本發明引用的所有范圍包括端值。例如，"蛋白 酶抑制劑的含量為〇? 〇〇5mol/L~0? 15mol/L"表示蛋白酶抑制劑的含量n為0? 005mol/ L ^ n ^ 0. 15mol/L〇
[0013] 本發明的優勢在于：1)添加蛋白酶抑制劑含量較少，成本低，也不影響后續分離 提純；2)隨甲醇流加的方式向發酵體系導入蛋白酶抑制劑與發酵底物直接添加相比，對細 胞生長影響更加溫和，有利于進一步增加重組蛋白表達量。
【具體實施方式】
[0014] 以下所述的是本發明的優選實施方式，本發明所保護的不限于以下優選實施方 式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發明創造構思的基礎上，做出的若干變形和 改進，都屬于本發明的保護范圍。
[0015] 實施例中所用的原料均可以通過商業途徑獲得，所用的菌種構建方法屬于本領域 技術人員公知常識，本發明所用菌種宿主細胞和表達載體，參照Invitrogen的Multi-Copy Pichia Expression Kit 和EasySelect? Pichia Expression Kit 的試劑盒說明，屬于技術 公知。本發明所舉實施例發酵方法，參照Invitrogen公司的Pichia Fermentation Process Guidelines中進行，其具體操作為：
[0016] 發酵培養基由BSM，1 %酵母提取物（Yeast Extract)和PTM1組成。BSM和酵母提 取物經121°(：高溫滅菌3〇1^11后，用50%氨水將口11調至5.0，再按4111171加入經無菌過濾的 PTM1即得。
[0017] 發酵分為三步：
[0018] 第一步：發酵培養基培養約20h ;
[0019] 第二步：以1〇1111711/1的速率流加含12111171^了111的50%甘油，時間為611。
[0020] 第三步：以6mL/h/L的速率流加含12mL/L PTM1的甲醇進行誘導。為使誘導過程 中的D0值不低于25 %，需調節甲醇流加速率，誘導72h，菌液0D600達到500以上后結束培 養。發酵培養過程中取發酵液，離心后取上清液HPLC檢測蛋白含量。
[0021] 實施例1
[0022] 畢赤酵母GS115重組表達羧肽酶B前體
[0023] 以甲醇流加誘導表達，不添加任何蛋白酶抑制劑，取80h及110h發酵液離心，HPLC 測定羧肽酶B前體表達量，以80h濃度為標準值100作為對照。實驗組發酵誘導前以相同 方法進行發酵，甲醇誘導過程分別于甲醇中添加0. 05mol/L苯甲脒鹽酸鹽與0. 05mol/L濃 度苯甲基磺酰氟（PMSF)，同時80h、110h取樣離心，HPLC測定羧肽酶B前體表達量，其與對 照組實驗對比結果如表1。
[0024] 表1添加蛋白酶抑制劑對羧肽酶B前體表達量的影響
[0025]
[0026] 實施例2
[0027] 畢赤酵母X33重組表達蛋白酶前體
[0028] 以甲醇流加誘導表達，不添加任何蛋白酶抑制劑，取80h及1 lOh發酵液離心，HPLC 測定胰蛋白酶前體表達量，以80h濃度為標準值100作為對照。實驗組發酵誘導前以相同 方法進行發酵，甲醇誘導過程分別于甲醇中添加0. 05mol/L苯甲脒鹽酸鹽與0. 05mol/L濃 度苯甲基磺酰氟（PMSF)，同時80h、110h取樣離心以HPLC測定胰蛋白酶前體表達量，其與對 照組實驗對比結果如表2。
[0029] 表2添加蛋白酶抑制劑對胰蛋白酶前體表達量的影響
[0030]
[0031] 實施例3
[0032] 畢赤酵母GS115重組表達羧肽酶B前體
[0033] 以甲醇流加誘導表達，不添加任何蛋白酶抑制劑，取80h及110h發酵液離心，HPLC 測定羧肽酶B前體表達量，以80h濃度為標準值100作為對照。實驗組發酵誘導前以相 同方法進行發酵，甲醇誘導過程分別于甲醇中添加〇? 001mol/L、0. 005mol/L、0. 05mol/L、 0? 10mol/L、0. 15mol/L、0. 20mol/L 濃度苯甲脈鹽酸鹽與 0? 005mol/L、0. 05mol/L、0. lOmol/ L、0. 15mol/L、0. 20mol/L濃度PMSF，同時80h、llOh取樣離心以HPLC測定羧肽酶B前體表 達量，其與對照組實驗對比結果如下表3和表4。
[0034] 表3添加苯甲脒鹽酸鹽對羧肽酶B前體表達量的影響
[0035]
[0038] 實施例4
[0039] 蛋白酶抑制劑添加方式對畢赤酵母GS115重組表達羧肽酶B前體的影響
[0040] 以甲醇流加誘導表達，基礎料分別添加與甲醇流加等量的苯甲脒鹽酸鹽或PMSF， 甲醇中不添加苯甲脒鹽酸鹽或PMSF，取80h及110h發酵液離心，HPLC測定羧肽酶B前體表 達量，以80h濃度分別作為標準值100對照。實驗組發酵誘導前以相同方法進行發酵，基礎 料不添加苯甲脒鹽酸鹽或PMSF，甲醇誘導過程分別于甲醇中添加0.05mol/L濃度苯甲脒鹽 酸鹽與0.05mol/L濃度PMSF，同時80h、110h取樣離心以HPLC測定羧肽酶B前體表達量，其 與對照組實驗對比結果如下表5。
[0041] 表5添加苯甲基磺酰氟對羧肽酶B前體表達量的影響
[0042]
【主權項】
1. 一種提高甲醇營養型酵母表達系統表達量的方法，其特征在于，在發酵誘導階段，流 加的甲醇中含有蛋白酶抑制劑。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑選自苯甲脒鹽酸鹽或 苯甲基磺酰氟。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑為苯甲脒鹽酸鹽。4. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑的含量為 0? 005mol/L ~0? 15mol/L。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述甲醇營養型酵母為巴斯德畢赤酵母。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白選自羧肽酶B前體、胰島素前體、 胰島素前體類似物、促胰高血糖素類前體或胰蛋白酶前體。
【專利摘要】本發明提供一種提高甲醇營養型酵母表達系統表達量的方法。通過加入蛋白酶抑制劑如苯甲脒鹽酸鹽于甲醇中，在發酵誘導階段流加進入發酵體系，可較好抑制菌體自身蛋白酶對重組蛋白的降解，從而提升重組蛋白表達量。<pb pnum="1" />
【IPC分類】C12P21/02, C12R1/84
【公開號】CN105039471
【申請號】CN201510175618
【發明人】寧榮良, 焦策, 張宏達, 封海生, 王超, 黃成潭, 李漢仁
【申請人】廣東東陽光藥業有限公司, 宜昌東陽光長江藥業股份有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年4月14日