一種微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]苯乳酸是一種對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌等具有廣譜抗菌性的新型抑菌劑，也是合成抗血小板凝聚和心肌梗塞藥物的前體，還可用于合成新型功能聚合物材料，在醫(yī)藥、食品、化妝品及材料領(lǐng)域有重要的應(yīng)用前景。傳統(tǒng)化學(xué)法合成苯乳酸過程中存在諸如需要使用高毒單體和催化劑、合成路線復(fù)雜、副產(chǎn)物多、環(huán)境污染、溶劑殘留等問題，影響了其安全性。近幾年，微生物轉(zhuǎn)化合成開始成為苯乳酸制備的新途徑。
[0003]已報(bào)道的微生物如植物乳桿菌、芽孢桿菌、白地霉菌、丙酸短棒菌、米根霉菌及熒光威克酵母菌等可代謝合成苯乳酸。其中，以苯丙酮酸為主要底物，利用植物乳桿菌為主力菌株，通過微生物轉(zhuǎn)化合成進(jìn)行苯乳酸的制備，是微生物法合成苯乳酸的主要途徑。但現(xiàn)有一些菌株在特定條件下會(huì)存在潛在的安全性問題，而安全性好的部分食品源產(chǎn)苯乳酸微生物常受限于產(chǎn)物和底物抑制，使苯乳酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)率低，濃度低，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)要求。因此，探索微生物合成苯乳酸的新途徑及新菌株，是目前迫切需要解決的問題，具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明目的是提供一種微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法。
[0005]所述的一種微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于以布氏乳桿菌為全細(xì)胞催化劑，對(duì)關(guān)鍵底物苯丙酮酸進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到苯乳酸。
[0006]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：
1)對(duì)布氏乳桿菌的菌體進(jìn)行通透化處理后，分散于緩沖溶液中，制成含微生物細(xì)胞的懸浮液；
2)向步驟1)得到的含微生物細(xì)胞的懸浮液中加入關(guān)鍵底物苯丙酮酸和輔助底物葡萄糖，進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸?？梢越?jīng)離心分離和產(chǎn)物純化等后續(xù)處理獲得所需純度的苯乳酸，離心分離和產(chǎn)物純化為常規(guī)技術(shù)。
[0007]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟1 )中對(duì)布氏乳桿菌的菌體進(jìn)行通透化處理所用的方法為凍融法，菌體冷凍溫度-15?_25°C，室溫解凍。
[0008]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟1 )中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液，其濃度為100 mM，pH為7?8。
[0009]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟1 )中含微生物細(xì)胞的懸浮液中菌體濃度為50?150 g/Lo
[0010]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟1 )中苯丙酮酸濃度為4?18 g/L，葡萄糖濃度為10?18 g/L。
[0011]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟2 )中的轉(zhuǎn)化合成溫度為25?45°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為4?6 h。
[0012]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化合成優(yōu)化條件為：菌體濃度100 g/L，苯丙酮酸濃度12 g/L，葡萄糖濃度14 g/L，溫度35°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間4 h。
[0013]所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述自動(dòng)控溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為60-80 rpmD
[0014]通過采用上述技術(shù)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
1)本發(fā)明利用布氏乳桿菌為催化劑，通過微生物轉(zhuǎn)化途徑合成苯乳酸的方法，其步驟少、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、操作簡單、無需使用高毒試劑和催化劑、成本低，規(guī)?；D(zhuǎn)化制備容易實(shí)現(xiàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景；
2)本發(fā)明所用的底物和緩沖溶液都是常規(guī)的，容易獲得和配制；所用的微生物菌株是來源于食品的安全微生物，可從傳統(tǒng)泡菜等發(fā)酵食品中方便地分離獲得，使得轉(zhuǎn)化合成的苯乳酸具有很好的安全性；
3)本發(fā)明通過凍融法對(duì)布氏乳桿菌細(xì)胞進(jìn)行通透化處理，無需采用有機(jī)溶劑通透化等常規(guī)微生物轉(zhuǎn)化用細(xì)胞的通透化方法，處理過程簡單方便，是安全高效的綠色化方法，無毒性；
4)本發(fā)明利用布氏乳桿菌通過微生物轉(zhuǎn)化途徑合成苯乳酸的方法，苯乳酸的轉(zhuǎn)化收率(苯乳酸產(chǎn)物與苯丙酮酸底物的摩爾比率)可達(dá)91%，轉(zhuǎn)化液中苯乳酸產(chǎn)物的濃度可達(dá)11 g/L，轉(zhuǎn)化收率和產(chǎn)率都較高，微生物轉(zhuǎn)化合成過程高效，優(yōu)于已有利用植物乳桿菌轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：
實(shí)施例1
將500 mg布氏乳桿菌菌體于_15°C進(jìn)行凍融處理，然后置于錐形瓶中室溫解凍，加入5 mL pH為8.0的100 mM Na2HP04_NaH2P04緩沖液，使菌體均勻分散，形成含微生物細(xì)胞的懸浮液；向該懸浮液中加入70 mg葡萄糖和20 mg苯丙酮酸，在自動(dòng)控溫?fù)u床上于30°C、轉(zhuǎn)速75 rpm下反應(yīng)時(shí)間4h后，從轉(zhuǎn)化液中取樣，離心后取上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測分析，分析條件為：Agilent 1260 infinity液相色譜系統(tǒng)，DAD檢測器（G1315D)，AgilentZorbax SB-C18色譜柱（4. 6 mmX150 mm, 5 ym);流動(dòng)相：水+0.05%三氟乙酸⑷和甲醇+0. 05%三氟乙酸(B)，梯度洗脫：0~20 min時(shí)候B由10%線性變化為100%, 20-23 min保持100%, 23-25 min線性降為10% ;流速1 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30°C，所得轉(zhuǎn)化液中苯乳酸含量為3. 3 g/L，轉(zhuǎn)化收率為81 %。
[0016]實(shí)施例2
將500 mg布氏乳桿菌菌體于-20°C進(jìn)行凍融處理，然后置于錐形瓶中室溫解凍，加入5mL pH為7. 5的100 mM Na2HP04_NaH2P04緩沖液，使菌體均勻分散，形成含微生物細(xì)胞的懸浮液；向該懸浮液中加入70 mg葡萄糖和60 mg苯丙酮酸，在自動(dòng)控溫?fù)u床上于35°C、轉(zhuǎn)速80 rpm下反應(yīng)時(shí)間4h后，從轉(zhuǎn)化液中取樣，8000 rpm離心15 min，取上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測分析（同上，下同)，所得轉(zhuǎn)化液中苯乳酸含量為11 g/L，轉(zhuǎn)化收率為91 %。
[0017]實(shí)施例3
將750 mg布氏乳桿菌菌體于-25°C進(jìn)行凍融處理，然后置于錐形瓶中室溫解凍，加入5mL pH為8的100 mM Na2HP04_NaH2P04緩沖液，使菌體均勻分散，形成含微生物細(xì)胞的懸浮液。向該懸浮液中加入90 mg葡萄糖和90 mg苯丙酮酸，在自動(dòng)控溫?fù)u床上于45°C、轉(zhuǎn)速75 rpm下反應(yīng)時(shí)間4h后，從轉(zhuǎn)化液中取樣，離心后取上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測分析，所得轉(zhuǎn)化液中苯乳酸含量為5. 1 g/L，轉(zhuǎn)化收率為28 %。
[0018]實(shí)施例4
將250 mg布氏乳桿菌菌體于-25°C進(jìn)行凍融處理，然后置于錐形瓶中室溫解凍，加入5mL pH為8的100 mM Na2HP04_NaH2P04緩沖液，使菌體均勻分散，形成含微生物細(xì)胞的懸浮液。向該懸浮液中加入50 mg葡萄糖和20 mg苯丙酮酸，在自動(dòng)控溫?fù)u床上于25°C、轉(zhuǎn)速75 rpm下反應(yīng)時(shí)間6h后，從轉(zhuǎn)化液中取樣，離心后取上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測分析，所得轉(zhuǎn)化液中苯乳酸含量為2. 4 g/L，轉(zhuǎn)化收率為60 %。
[0019]實(shí)施例5
將500 mg布氏乳桿菌菌體于-20°C進(jìn)行凍融處理，然后置于錐形瓶中室溫解凍，加入5mL pH為7.0的100 mM Na2HP04_NaH2P04緩沖液，使菌體均勻分散，形成含微生物細(xì)胞的懸浮液。向該懸浮液中加入50 mg葡萄糖和20 mg苯丙酮酸，在自動(dòng)控溫?fù)u床上于30°C、轉(zhuǎn)速60 rpm下反應(yīng)時(shí)間4h后，從轉(zhuǎn)化液中取樣，離心后取上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測分析，所得轉(zhuǎn)化液中苯乳酸含量為3. 5 g/L，轉(zhuǎn)化收率為86 %。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于以布氏乳桿菌為全細(xì)胞催化劑，對(duì)關(guān)鍵底物苯丙酮酸進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到苯乳酸。2.如權(quán)利要求1所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: 1)對(duì)布氏乳桿菌的菌體進(jìn)行通透化處理后，分散于緩沖溶液中，制成含微生物細(xì)胞的懸浮液； 2)向步驟I)得到的含微生物細(xì)胞的懸浮液中加入關(guān)鍵底物苯丙酮酸和輔助底物葡萄糖，在自動(dòng)控溫?fù)u床中進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸。3.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟I)中對(duì)布氏乳桿菌的菌體進(jìn)行通透化處理所用的方法為凍融法，菌體冷凍溫度-15?-25°C，室溫解凍。4.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟I)中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖液，其濃度為100 mM，pH為7?8。5.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟I)中含微生物細(xì)胞的懸浮液中菌體濃度為50?150 g/Lo6.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟I)中苯丙酮酸濃度為4?18 g/L，葡萄糖濃度為10?18 g/Lo7.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于步驟2)中的轉(zhuǎn)化合成溫度為25?45°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間為4?6 h。8.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化合成優(yōu)化條件為:菌體濃度100 g/L,苯丙酮酸濃度12 g/L,葡萄糖濃度14 g/L,溫度35°C，轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)間4 ho9.如權(quán)利要求2所述的微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，其特征在于所述自動(dòng)控溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為60-80 rpm。
【專利摘要】一種微生物轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的方法，屬于生物化工合成技術(shù)領(lǐng)域。所述方法是以苯丙酮酸為關(guān)鍵底物，以凍融通透化處理的布氏乳桿菌菌體為全細(xì)胞催化劑，在一定溫度條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化合成苯乳酸。本發(fā)明優(yōu)化條件下苯乳酸的轉(zhuǎn)化收率可達(dá)91%，轉(zhuǎn)化液中苯乳酸產(chǎn)物的濃度可達(dá)11g/L。所用菌種為源于食品的安全微生物，其通透化處理過程簡單方便，安全無毒性；微生物轉(zhuǎn)化過程步驟少，時(shí)間短，成本低，轉(zhuǎn)化收率高，可實(shí)現(xiàn)安全快速合成制備，在苯乳酸制備領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12R1/225, C12P7/42
【公開號(hào)】CN105039434
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510565255
【發(fā)明人】贠軍賢, 倪正, 關(guān)今韜, 沈紹傳, 張頌紅, 韓朝飛
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年9月8日