生防菌株x1發酵培養基及小型發酵工藝的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，涉及一種枯草芽孢桿菌XI的發酵培養基及利用該 培養基進行發酵的工藝。
【背景技術】
[0002] 拮抗能力強且抗菌譜廣的優良菌種是中草藥土傳病害生物防治研究和微生物菌 劑研制的關鍵，而適宜的生產方法和培養條件則是發揮優良菌種性能的保證。在篩選獲得 高效廣譜生防菌株后，為最終達到產業開發目的，需要對目的菌株進行液體深層發酵研究， 包括適合工業化生產的培養基篩選、液體發酵條件的優化和中試生產工藝的確定。
[0003] 搖瓶發酵與發酵罐發酵對微生物的生長存在很大差異，將搖瓶發酵的實驗條件直 接放大到生產罐，菌株的生長往往不相一致。為了能夠適應工業生產的需要，消除這兩種規 模發酵結果的差異，將搖瓶發酵的實驗結果有效的應用到大型生產當中去，就必須經過實 驗室小型發酵罐發酵條件研究。在了解菌株在發酵罐中的代謝規律的情況下，合理建立小 型發酵罐的發酵工藝后，才能進行中試規模的發酵研究或工廠規模的發酵研究。
[0004] 中間試驗是小試完成后，在概念設計基礎上進行的，介于實驗室裝置與工業裝置 之間的研究型試驗，是工程研究的基礎，也是過程開發的一個重要環節。通過中試后，可使 工業裝置獲取相對較大的安全系數，及早發現實驗室工作無法觀察到的現象，糾正設計中 可能出現的失誤。中試工作必須按工業化條件進行，其目的和作用如下：（1)建立一定規模 的工業模擬裝置，對新工藝過程進行全面模擬考察，明確操作條件和控制方法。（2)考察實 驗室研究結果在工業規模下實現的技術及經濟可行性。（3)考察工業因素對工藝過程和設 備的影響，發現和解決實際生產條件下可能發生的各種問題。
[0005] -般來說微生物在不同體積的反應器中的生長速率是不同的，原因可能是，罐的 深度造成氧的溶解度、空氣停留時間和分布不同，剪切力不同，滅菌時營養成分破壞程度不 同所致。發酵罐的規模變化，無論是絕對值還是相對值都會引起許多物理和生物參數的改 變，從而很難使大、小規模過程中菌體所處的外界環境保持一致，在放大生產時就會常常出 現發酵生產水平不穩定或者發酵產率太低，最終導致研究成果長期停留在實驗室的研究階 段，無法進行大規模生產應用。要將實驗室研究中的優化培養或發酵結果轉移到工業規模 的發酵生產過程中去，保證規模放大后能夠在大規模的工業化生產中同樣取得成功的效 果，則需要進行規模更大一些的發酵條件的研究或工廠規模的中間試驗，以驗證在實驗室 研究階段的發酵工藝，然后才能放大到工廠規模的發酵生產。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種生防菌株XI發酵培養基及小型發酵工藝，為進行該菌 株的工業化生產提供實驗基礎和依據。
[0007] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0008] -種生防菌株XI發酵培養基，包括如下成分：葡萄糖1. 0~1. 5%，酵母膏0. 5~ 0.8%，淀粉0? 1~0.3%，磷酸氫二鈉0.2~0.4%，磷酸二氫鈉0? 10~0.20%，硫酸鎂 0. 04~0.06 %，碳酸鈣0.05~0. 15 %，硫酸錳0.05~0. 15%，加蒸餾水至1000毫升，調 節pH7. 5-8. 0,115°C滅菌 25 分鐘。
[0009] -種利用上述培養基對生防菌株XI進行小型發酵的工藝，包括如下步驟：
[0010] (1)用4~6mLNYD培養基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后轉接入裝有 80~120mL種子培養基的500mL三角瓶中，于20~40°C，100~200r/min條件下培養16~ 18h，制成種子發酵液。
[0011] (2)將種子發酵液接種到裝有60~80L培養基的100L發酵罐中通氣攪拌培養，保 持發酵溫度28~30°C;攪拌速度100~120r/min;通氣量0. 8~1. 0 (V/V?min);接種量 1. 5~2. 0% ;發酵時間36~40h。
[0012] 本發明具有如下優點：
[0013] 1、培養基簡單易得且成本低，所有成分可溶解，為生產后期處理方便可行；
[0014] 2、本發明對生防菌株XI進行小型發酵罐的生產發酵，確定菌株自控發酵工藝，為 大規模的工業化生產提供了技術依據。
【附圖說明】
[0015] 圖1為菌株XI生長曲線（100L);
[0016] 圖2為不同培養時間菌液的pH值（100L)。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合附圖對本發明的技術方案作進一步的說明，但并不局限于此，
[0018] 凡是對本發明技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神 和范圍，均應涵蓋在本發明的保護范圍中。
[0019] 本發明提供了一種生防菌株XI的小型發酵工藝，包括以下內容：
[0020] 1材料與方法
[0021] 1. 1 菌株
[0022]生防菌株 XI:CGMCCN0. 4037。
[0023] 1. 2培養基
[0024] 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氫二鈉0.3%，磷酸二氫鈉0. 15%， 硫酸鎂0. 05%，碳酸鈣0. 01 %，硫酸錳0. 01 %。調節PH7. 5-8. 0,115°C滅菌25分鐘。
[0025]1. 3生防菌株XI的100L自控罐液體深層發酵研究
[0026] 采用發酵罐（江蘇鎮江MCGS-100L)進行發酵培養，其操作如下：
[0027] (1)培養前的發酵罐要做好準備工作，確保電源供應，檢查冷卻水水源，檢查空氣 氣源；在發酵罐內注入培養基，培養基必須浸沒攪拌槳葉；打開排氣過濾器頂部的排氣閥；
[0028](2)在溫度控制器上設定發酵溫度和滅菌溫度；
[0029] (3)選擇控制模式中的"滅菌"項，滅菌開始；
[0030] (4)滅菌結束后，待溫度冷卻到發酵溫度后，在接種口上方點燃纏酒精棉的鐵圈， 打開接種口，接入培養好的種子液；選擇控制模式中的"發酵"項，發酵開始；
[0031](5)定時取發酵液，檢測菌濃度和芽孢形成狀況，確定最佳的培養時間。
[0032] 用5mLNYD培養基活化存于-70 °C冰柜中枯草芽孢桿菌菌種，然后轉接入裝有 100mL種子培養基的500mL三角瓶中，于30°C，150r/min條件下培養18h，制成種子發酵液。 將種子發酵液按1.5%的接種量接種到裝有751培養基的（1?1^-1001)發酵罐中，在30 1€ 的條件下，保持通氧量在50%的水平，通氣攪拌培養。在發酵過程中，每隔6h取樣測定發酵 液的〇D6。。值，繪制菌株生長曲線。另外每隔8h取樣測定發酵液的pH值。
[0033] 2結果與分析
[0034] 在生防菌株XI的中試發酵中，為了降低生產成本，提高芽孢形成率，用酵母膏替 代培養基中的牛肉膏，同時增加了MgS04、CaC03和、MnS0 43種無機鹽成分，以優化的培養條 件（培養溫度30°(：，初始？11值7.5，接種齡16~1811)為基本條件，在751裝液量，1.5%接 種量下以轉速180r/min，通氣量1:1VVM進行XI菌株100L罐的自控發酵。
[0035] 2. 1菌株生長曲線的測定
[0036] 在液體發酵過程中，菌體形態和菌液濃度直接反映菌株的生長情況。菌體形態可 通過顯微鏡觀察；菌液濃度的測定是衡量生產菌在整個培養過程中菌體量的變化。一般發 酵前期菌濃度增長很快，中期菌濃度基本恒定。在本發明中菌體生長延滯期很短，之后進入 對數生長期，經過24h對數生長期結束，菌體的生長轉入平穩期（見圖1)，菌體在30h左右 開始形成芽孢，40h達到最大值，芽孢形成率達95%以上。
[0037] 2. 2發酵液pH值的測定
[0038] 發酵液pH值是微生物代謝的綜合反映，又影響代謝的進行，所以是十分重要的參 數。在發酵過程中，隨著菌體對營養物質的利用和代謝產物的積累，發酵液的pH必然會發 生變化，通過觀察pH值變化規律可以了解發酵的正常與否。
[0039] pH值的變化是微生物代謝狀況的綜合反映一一基質代謝、產物合成、細胞狀態、營 養狀況、供氧狀況。在XI菌株100L自控罐發酵過程中，培養液初始pH值調為7. 5,發酵 前期隨著菌體的生長和繁殖，發酵液的pH值逐漸下降，說明菌體大量利用糖產生了酸性物 質。當發酵至20h時，發酵液的pH值下降至6. 5,而后開始逐步回升，此時芽孢開始逐漸形 成，發酵至30h時，發酵液的pH值已升至7. 8,持續至下罐時，發酵液的pH值保持在8. 0左 右（見圖2)。
[0040] 2. 3發酵液活芽孢數的測定
[0041] 在XI菌株每一批100L自控罐發酵結束后，取菌液測定發酵液中的活芽孢數。結 果5批次發酵菌液的活芽孢數為14. 1~16. 3億/mL，平均為14. 9億/mL(見表1)。
[0042] 表1 XI菌株100L自控罐發酵結果
[0043]
【主權項】
1. 一種生防菌株Xl發酵培養基，其特征在于所述培養基配方如下：葡萄糖1.0 ~ 1. 5%，酵母膏0. 5~0. 8 %，淀粉0. 1~0. 3 %，磷酸氫二鈉0. 2~0. 4%，磷酸二氫鈉 0? 10~0.20%，硫酸鎂0.04~0.06%，碳酸鈣0.05~0? 15%，硫酸錳0.05~0? 15%，加 蒸餾水至1000毫升。2. 根據權利要求1所述的生防菌株Xl發酵培養基，其特征在于所述培養基配方如下： 葡萄糖1.5%，酵母膏0.5%，淀粉0. 1%，磷酸氫二鈉0.3%，磷酸二氫鈉0. 15%，硫酸鎂 0. 05%，碳酸鈣0. 01 %，硫酸錳0. 01 %。3. -種生防菌株Xl小型發酵工藝，其特征在于所述工藝步驟如下： (1) 用4~6mLNYD培養基活化存于-70°C冰柜中生防菌株XI，然后轉接入裝有80~ 120mL種子培養基的500mL三角瓶中，于20~40°C，100~200r/min條件下培養16~18h， 制成種子發酵液。 (2) 將種子發酵液接種到裝有60~80L培養基的100L發酵罐中通氣攪拌培養，培養基 配方如下：葡萄糖I. 〇~1. 5 %，酵母膏0. 5~0. 8 %，淀粉0. 1~0. 3 %，磷酸氫二鈉0. 2~ 0. 4 %，磷酸二氫鈉0. 10~0. 20 %，硫酸鎂0. 04~0. 06 %，碳酸鈣0. 05~0. 15 %，硫酸錳 0. 05~0. 15 %，加蒸餾水至1000毫升，保持發酵溫度28~30°C;攪拌速度100~120r/ min;通氣量0? 8~I. 0V/V?min;接種量L5~2. 0% ;發酵時間36~40h。4. 根據權利要求3所述的生防菌株Xl小型發酵工藝，其特征在于所述培養溫度30°C， 裝液量75L，接種量1. 5%，轉速180r/min，通氣量I. 0V/V ? min。
【專利摘要】本發明公開了一種生防菌株X1發酵培養基及小型發酵工藝，所述培養基包括如下成分：葡萄糖1.0～1.5％，酵母膏0.5～0.8％，淀粉0.1～0.3％，磷酸氫二鈉0.2～0.4％，磷酸二氫鈉0.10～0.20％，硫酸鎂0.04～0.06％，碳酸鈣0.05～0.15％，硫酸錳0.05～0.15％，加蒸餾水至1000毫升，調節pH7.5-8.0，115℃滅菌25分鐘。小型發酵工藝如下：(1)用4～6mLNYD培養基活化存于-70℃冰柜中生防菌株X1，然后轉接入裝有80～120mL種子培養基的500mL三角瓶中，于20～40℃，100～200r/min條件下培養16～18h，制成種子發酵液。(2)將種子發酵液接種到裝有60～80L培養基的100L發酵罐中通氣攪拌培養。本發明可為進行該菌株的工業化生產提供實驗基礎和依據。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/125
【公開號】CN105039230
【申請號】CN201510599801
【發明人】李晶, 于麗萍, 姜竹, 張淑梅, 孟利強, 陳靜宇, 曹旭, 姜威, 劉宇帥, 胡基華
【申請人】黑龍江省科學院微生物研究所
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年9月18日