一株深海環狀芽孢桿菌及其抑制黃曲霉毒素的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及深海微生物技術與真菌毒素生物防控技術領域，具體的說是一株深海環狀芽孢桿菌及其抑制黃曲霉毒素的應用。
【背景技術】
[0002]黃曲霉毒素是目前在自然界中已發現的毒性最強的真菌毒素，并具有強致癌、致畸和免疫抑制性，被國際癌癥機構列為一類致癌物質。主要由黃曲霉、寄生曲霉等絲狀真菌產生，可廣泛污染糧食、飼料等，人類和動物食用被黃曲霉毒素污染的食物和飼料后，可嚴重危害人類和動物的健康，因此，如何有效防控黃曲霉毒素污染是全球亟待解決的重大課題。
[0003]有效防控黃曲霉毒素污染飼料和糧食的首選方法是抑毒，即抑制黃曲霉毒素在飼料和糧食中的產生，而不是除毒，即清除已經產生的黃曲霉毒素，因為除毒不僅成本大，效果也不理想，難以根除，并會導致營養的損失。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是克服上述現有技術的不足，本發明解決上述技術問題采用的技術方案是:一株深海環狀芽孢桿菌及其抑制黃曲霉毒素的應用，其特征包括如下步驟:
(1)本發明所說的深海環狀芽孢桿菌為環狀芽孢桿菌FA13菌株circulansFA13)，并已于2015年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.10663 ；
(2)本發明所說的FA13菌株分離自南大西洋3203米水深的淺黃色軟泥沉積物，通過以下方法分離獲得:新鮮的淺黃色軟泥10倍系列稀釋液經55°C水浴6min后，涂布于高氏一號培養基，28度下恒溫培養，及時挑取單菌落，并經進一步劃線純化，獲得純菌種FA13菌株;
(3)本發明所說的FA13菌株經16SrRNA基因分子鑒定為環狀芽孢桿菌的一個新菌株，菌體呈桿狀，可產生芽孢，革蘭氏染色陽性；
(4)將本發明的深海環狀芽孢桿菌FA13菌株接種于優化培養基中，在20-36°C溫度下，振蕩培養4-12天，即可得到含有高效活性物質的發酵液，該發酵液即使稀釋30倍后，仍可100%抑制黃曲霉毒素產生菌的孢子萌發和黃曲霉毒素的合成，稀釋40倍后，仍可100%抑制黃曲霉毒素的合成。
[0005](5)本發明的FA13菌株的發酵液中的活性物質性質穩定，在121°C高溫高壓下處理30分鐘后活性不喪失；在？!12-12的范圍內處理6小時后活性不喪失；用胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶等在適宜條件下酶解6小時后活性仍不喪失；
(6)本發明的FA13菌株的發酵液中的活性物質具有良好的生物安全性，對大腸桿菌、產氣桿菌等腸道菌群無抑制作用，對單細胞真菌釀酒酵母也沒有抑制作用；(7)本發明的深海環狀芽孢桿菌FA13菌株及其發酵液可應用于飼料、糧食、大田作物
等的黃曲霉毒素污染的有效防控。
【具體實施方式】
[0006]下面結合實施例對本發明做進一步說明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。
[0007]實施例1:深海環狀芽孢桿菌FA13菌株的液體發酵
將過夜培養的FA13菌株的液體種子，按1%接種量接種到含有0.5-1.5%酵母膏、0.1-0.3%麥芽糖和1.0-3.0%葡萄糖的液體培養基中，在20-36度、100-120轉/分鐘下培養6-12天，結束發酵，對發酵液進行離心，獲得的無細胞上清液即是含有高效抑制黃曲霉毒素的活性物質的發酵液，可直接用于防控黃曲霉毒素的污染，或者加工成干粉用于防控黃曲霉毒素的污染。
[0008]實施例2:深海環狀芽孢桿菌FA13菌株的發酵液及其稀釋液抑制黃曲霉毒素的活性
將實施例1獲得的無細胞發酵上清液中加入與發酵培養基等量的營養成分后作為培養黃曲霉毒素產生菌的培養液，以及將實施例1獲得的無細胞發酵上清液用發酵培養基分別稀釋30倍和40倍后作為培養黃曲霉毒素產生菌的培養液，對照為發酵培養基，向上述培養基中分別接種1%的黃曲霉毒素產生菌的孢子懸液后，在28度培養6天，離心收集菌絲體，稱重后，用甲醇-氫氧化鈉溶液提取菌絲體中的黃曲霉毒素中間產物，在560nm處測量吸光值，計算抑菌率和抑毒率，結果表明，未稀釋的無細胞發酵上清液和稀釋30倍的無細胞發酵上清液中接種的黃曲霉毒素產生菌的孢子沒有萌發，將其重新接種到適宜孢子萌發生長的培養基中6天后，仍無孢子萌發，表明黃曲霉毒素產生菌的孢子在FA13菌株的無細胞發酵上清液中培養后已經被殺死，因而，FA13菌株的無細胞發酵上清液和稀釋30倍的無細胞發酵上清液具有完全殺死孢子和抑制黃曲霉毒素產生的能力，對稀釋40倍的FA13無細胞發酵上清液的檢測表明對菌絲生長的抑制率達80%以上，對黃曲霉毒素產生的抑制率達 100%。
[0009]
實施例3:深海環狀芽孢桿菌FA13菌株的發酵液中的活性物質的溫度穩定性將實施例1獲得的無細胞發酵上清液在60、80°C溫度下加熱處理2小時后自然冷卻至室溫、以及在121°C下高壓滅菌30分鐘后自然冷卻至室溫，將上述處理的發酵液、未經過溫度處理的發酵液、和空白培養基一起分別接種1%的黃曲霉毒素產生菌的孢子懸液后，在28度培養6天，觀察孢子萌發情況，結果表明即使在121°C下高壓滅菌30分鐘的發酵液也能與未經過溫度處理的發酵液一樣，完全抑制黃曲霉毒素產生菌的孢子萌發和黃曲霉毒素的產生，表明發酵液中的抑菌抑毒活性物質具有溫度穩定性。
【主權項】
1.一株分離自南大西洋3203米水深的淺黃色軟泥沉積物的深海菌株，為環狀芽孢桿菌FA13菌株circulans FA13)，已于2015年3月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.10663。
【專利摘要】本發明提供一株可防控黃曲霉毒素的深海菌株，為環狀芽孢桿菌FA13菌株（<i>Bacillus？circulans</i>？FA13），分離自南大西洋3203米水深的淺黃色軟泥沉積物，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC？No.10663。將FA13菌株在優化條件下發酵，獲得的發酵上清液30倍稀釋后，仍可殺死黃曲霉毒素產生菌的孢子和100%抑制黃曲霉毒素的產生，即具有從生長源頭抑制黃曲霉毒素產生的能力，而對腸道菌群和單細胞真菌釀酒酵母則無抑制作用，具有更高的使用安全性；發酵液中的活性代謝產物性質穩定，具有耐高溫、耐酸堿、和耐胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的降解。本發明的FA13菌株及其發酵產物可用于飼料、糧食、大田作物等的黃曲霉毒素污染的有效防控。CGMCC No.1066320150324
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/09
【公開號】CN105039199
【申請號】CN201510314566
【發明人】閆培生, 王文威, 邵宗澤, 王凱, 曹立新, 賈文文
【申請人】哈爾濱工業大學（威海）, 中國大洋礦產資源研究開發協會
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2015年6月10日